Аскорбиновая кислота: Комплексное исследование синтеза, фармакопейного анализа и разработка валидированного метода для растительных продуктов

В мире, где здоровье становится главной ценностью, вопрос дефицита витаминов приобретает особую остроту. По статистике, физиологическая потребность в витамине С для взрослого человека составляет от 60 до 120 мг в сутки, однако для многих этот показатель остаётся недостижимым. Аскорбиновая кислота, или витамин С, – это не просто химическое соединение, а эссенциальный компонент, играющий ключевую роль в поддержании жизненно важных функций организма. Её недостаток может привести к серьёзным нарушениям, поэтому точное и надёжное определение её содержания в различных продуктах и фармацевтических препаратах является критически важной задачей.

Однако, несмотря на очевидную значимость аскорбиновой кислоты, её анализ сопряжён с рядом сложностей. Высокая нестабильность соединения, чувствительность к свету, температуре, кислороду и pH, а также присутствие мешающих веществ в сложных природных матрицах, таких как растительное сырьё, делают процесс определения крайне требовательным к методикам. Существующие фармакопейные методы, зачастую основанные на визуальном титровании, демонстрируют недостаточную специфичность и высокую погрешность, что затрудняет объективную оценку содержания витамина С в лекарственном растительном сырье (ЛРС) и препаратах.

Настоящая курсовая работа ставит своей целью не только глубоко исследовать аскорбиновую кислоту с момента её синтеза до современных методов анализа, но и разработать новый, валидированный метод количественного определения этого ценного соединения в растительных продуктах. Работа охватывает химическую структуру, биологические функции, особенности синтеза, а также детально сравнивает качественные и количественные методы анализа, регламентированные ведущими мировыми фармакопеями. Особое внимание будет уделено обоснованию и пошаговому описанию разработки нового аналитического метода, призванного преодолеть ограничения существующих подходов и обеспечить высокую точность и специфичность определения аскорбиновой кислоты в условиях сложных растительных матриц.

Биологическая роль и физико-химические характеристики аскорбиновой кислоты

Аскорбиновая кислота, широко известная как витамин С, представляет собой одно из наиболее изученных и важных органических соединений в контексте человеческого здоровья. Её многогранная биологическая роль и уникальные физико-химические свойства делают её объектом постоянного внимания со стороны учёных и фармацевтов, ёмко подчёркивая неоспоримую значимость этого соединения для поддержания оптимального функционирования организма.

Химическая структура и основные физические свойства

Химически аскорбиновая кислота является органическим соединением с брутто-формулой C₆H₈O₆. Известна её изомерия, причём биологически активен только L-изомер, L-аскорбиновая кислота, что подчёркивает стереохимическую специфичность её взаимодействия с биологическими системами.

Визуально аскорбиновая кислота представляет собой белый или почти белый кристаллический порошок с характерным кислым вкусом, иногда встречающийся в виде бесцветных кристаллов. Её физические свойства включают:

• Растворимость: Легко растворима в воде и спирте, что обеспечивает её высокую биодоступность и возможность применения в различных лекарственных формах. Практически нерастворима в хлороформе.
• Температура плавления: Для L-аскорбиновой кислоты составляет 190–192 °C, причём при этой температуре происходит её разложение.
• Удельное оптическое вращение: [α]²⁰_D + 23° для D-линии натрия при концентрации 1,6 г в 100 мл воды, что является важным параметром для контроля чистоты и идентичности.
• Спектральные характеристики: Водные растворы аскорбиновой кислоты бесцветны и не поглощают в видимой области спектра. Однако в ультрафиолетовой области наблюдаются характерные максимумы поглощения: при 243 нм в кислой среде (0,1 М раствор хлороводородной кислоты) и при 265 нм в нейтральной среде (фосфатный буферный раствор pH 7,0). Эти максимумы используются в спектрофотометрических методах анализа.
• Кислотность: Аскорбиновая кислота является слабой кислотой, что обусловлено наличием двух ионизирующихся гидроксильных групп. Значения констант диссоциации (pK_а) составляют 4,25 для гидроксильной группы при 3-м атоме углерода и 11,79 для гидроксильной группы при 2-м атоме.

Биологическое значение и метаболические функции

Роль аскорбиновой кислоты в организме человека трудно переоценить. Она является мощным природным антиоксидантом, восстановителем и коферментом для ряда жизненно важных ферментативных реакций.

Основные биологические функции аскорбиновой кислоты:

• Антиоксидантная защита: Нейтрализует супероксидный радикал, защищая клетки от окислительного стресса. Также участвует в регенерации других антиоксидантов, таких как убихинон (кофермент Q10) и витамин Е.
• Синтез коллагена: Аскорбиновая кислота является критически важным кофактором для ферментов пролилгидроксилазы и лизилгидроксилазы. Эти ферменты осуществляют гидроксилирование аминокислот пролина и лизина в молекуле проколлагена, что необходимо для формирования стабильной тройной спирали коллагена. Коллаген, в свою очередь, является основным структурным белком соединительной, костной и хрящевой тканей, а также кожи и стенок кровеносных сосудов.
• Синтез нейромедиаторов и гормонов: Витамин С участвует в синтезе серотонина из триптофана, катехоламинов (например, адреналина и норадреналина), которые являются нейромедиаторами, влияющими на настроение, память и реакцию на стресс. Он также необходим для синтеза кортикостероидов, гормонов надпочечников.
• Детоксикация: Участвует в процессах детоксикации в гепатоцитах при участии системы цитохрома P450 и способствует превращению холестерина в желчные кислоты, играя роль в метаболизме липидов.
• Иммуномодулирование: Стимулирует синтез интерферона, укрепляя иммунную систему и повышая сопротивляемость организма к инфекциям. Способствует работе иммунных клеток, сокращая окислительный стресс и ускоряя выздоровление при вирусных и острых респираторных заболеваниях.
• Поддержание проницаемости капилляров: Поддерживает коллоидное состояние межклеточного вещества и нормальную проницаемость капилляров, угнетая активность фермента гиалуронидазы.
• Метаболизм других веществ: Активирует протеолитические ферменты, участвует в обмене ароматических аминокислот, пигментов и холестерина, а также способствует накоплению гликогена в печени.

Важно отметить, что большинство приматов (включая человека), морские свинки, некоторые виды птиц и рыб не способны синтезировать витамин С самостоятельно из-за отсутствия фермента L-гулонолактон оксидазы и должны получать его с пищей.

Факторы, влияющие на стабильность аскорбиновой кислоты

Несмотря на свою жизненно важную роль, аскорбиновая кислота является крайне нестабильным соединением, что создаёт значительные трудности при её хранении, переработке и анализе. Её разрушение может происходить под воздействием множества факторов:

• Температура: Аскорбиновая кислота начинает разрушаться уже при температуре 60 °C, а интенсивность распада значительно возрастает при дальнейшем повышении температуры. Это объясняет потери витамина С при термической обработке пищи.
• pH водного раствора: Распад аскорбиновой кислоты значительно ускоряется при понижении pH водного раствора, особенно в диапазоне pH < 7,0. Однако и в сильнощелочной среде она также нестабильна.
• Кислород воздуха: Аскорбиновая кислота легко окисляется кислородом воздуха, превращаясь в дегидроаскорбиновую кислоту, которая хотя и сохраняет некоторую биологическую активность, но является менее стабильной.
• Свет: Воздействие света, особенно ультрафиолетового спектра, катализирует процессы окисления и разложения витамина С. Например, листовые овощи, подвергающиеся воздействию света, быстро теряют свою витаминную ценность.
• Присутствие ионов металлов: Ионы переходных металлов, в особенности меди (Cu) и железа (Fe), являются мощными катализаторами окисления аскорбиновой кислоты, значительно ускоряя её деградацию.

Примеры нестабильности в реальных условиях:

• Приготовление пищи: При длительной варке или жарке продуктов, богатых витамином С, его содержание может значительно уменьшаться.
• Хранение продуктов: Квашеная капуста, покрытая рассолом, в течение 6-7 месяцев почти не теряет витаминной ценности, так как рассол создаёт анаэробные условия и кислую среду. Однако та же капуста, хранящаяся в открытой посуде без рассола, может потерять до 75% аскорбиновой кислоты всего за 24 часа из-за доступа кислорода.
• Упаковка: Для сохранения витамина С продукты часто упаковывают в светонепроницаемую и герметичную тару, чтобы минимизировать контакт с кислородом и светом.

Понимание этих факторов критически важно не только для сохранения пищевой ценности продуктов, но и для разработки адекватных методов анализа, требующих стабилизации образцов и проведения исследований в строго контролируемых условиях.

Методы синтеза аскорбиновой кислоты

История получения аскорбиновой кислоты — это путь от сложного выделения из природных источников до эффективных промышленных синтезов. Сегодня основное производство базируется на биотехнологических и химических подходах, истоки которых лежат в фундаментальных открытиях начала XX века.

Промышленный синтез из глюкозы

В современном промышленном производстве аскорбиновая кислота преимущественно синтезируется из D-глюкозы, доступного и относительно недорогого сырья. Этот процесс представляет собой изящное сочетание биотехнологических и химических стадий, что позволяет добиться высокой эффективности и выхода продукта.

Ключевым этапом является ферментация D-глюкозы, в которой участвуют определённые микроорганизмы. Эти микроорганизмы катализируют ряд превращений, ведущих к образованию предшественников аскорбиновой кислоты. Например, Gluconobacter oxydans широко используется для окисления D-сорбита (полученного из глюкозы) в L-сорбозу. Другие микроорганизмы, такие как Erwinia herbicola и Corynebacterium spp., могут напрямую превращать глюкозу в 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту (2,5ДКГ), а затем в 2-кето-L-гулоновую кислоту (2-КЛГ). Последняя является ключевым промежуточным продуктом в многостадийном синтезе аскорбиновой кислоты.

После ферментации промежуточные продукты подвергаются дальнейшей химической модификации, очистке и кристаллизации для получения конечного продукта — чистой аскорбиновой кислоты. Такой комбинированный подход позволяет оптимизировать процесс, сочетая специфичность ферментативных реакций с эффективностью химических трансформаций.

Метод Рейхштейна: Детальное описание стадий

Метод Рейхштейна, разработанный Тадеушем Райхштейном и его коллегами в 1933 году, стал настоящим прорывом в производстве L-аскорбиновой кислоты. Этот химико-микробиологический метод был первым успешным путём синтеза витамина С из D-глюкозы и послужил основой для многих последующих модификаций и усовершенствований.

Рассмотрим ключевые стадии метода Рейхштейна:

1. Гидрирование D-глюкозы в D-сорбит.
   • Принцип: На этой стадии D-глюкоза, являющаяся альдогексозой, подвергается каталитическому гидрированию (восстановлению карбонильной группы) с образованием многоатомного спирта — D-сорбита.
   • Условия: Реакция проводится при высокой температуре и давлении в присутствии катализатора, обычно никеля (например, никель Ренея).
   • Уравнение реакции:
     C6H12O6 (глюкоза) + H2 (водород) → C6H14O6 (D-сорбит)
2. Микробиологическое окисление D-сорбита до L-сорбозы.
   • Принцип: D-сорбит окисляется до L-сорбозы с участием микроорганизмов. Это пример биоконверсии, где микроорганизмы проявляют высокую регио- и стереоселективность.
   • Микроорганизм: Традиционно используется Acetobacter suboxydans.
   • Условия: Ферментация проводится при контролируемом pH (обычно 4–6) и температуре около 30 °C.
   • Выход: На этой стадии может быть достигнут очень высокий выход L-сорбозы, до 90% и более.
   • Уравнение реакции:
     C6H14O6 (D-сорбит) + ½ O2 (кислород) Acetobacter suboxydans→ C6H12O6 (L-сорбоза) + H2O (вода)
3. Защита гидроксильных групп L-сорбозы.
   • Принцип: Для предотвращения нежелательных побочных реакций на следующих стадиях синтеза, некоторые гидроксильные группы L-сорбозы временно защищаются. Это достигается путём образования ацеталя с ацетоном в кислой среде, что приводит к образованию диацетон-L-сорбозы.
   • Уравнение реакции:
     C6H12O6 (L-сорбоза) + 2(CH3)2CO (ацетон) H+→ Диацетон-L-сорбоза + 2H2O
4. Окисление диацетон-L-сорбозы.
   • Принцип: Диацетон-L-сорбоза подвергается сильному окислению. Это реакция, которая вводит карбоксильную группу в молекулу.
   • Реагент: Чаще всего используется перманганат калия (KMnO₄) или другие сильные окислители.
   • Последующий этап: После окисления проводится нагревание с водой, что приводит к гидролизу защитных групп и получению 2-кето-L-гулоновой кислоты.
   • Уравнение реакции (упрощенное):
     Диацетон-L-сорбоза + [O] → Диацетон-2-кето-L-гулоновая кислота → 2-кето-L-гулоновая кислота
5. Замыкание кольца (гамма-лактонизация) 2-кето-L-гулоновой кислоты.
   • Принцип: Это ключевой этап, на котором происходит образование циклической структуры аскорбиновой кислоты. 2-кето-L-гулоновая кислота претерпевает внутримолекулярную циклизацию с отщеплением молекулы воды (дегидратацию) и образованием гамма-лактона, который и является L-аскорбиновой кислотой.
   • Условия: Реакция часто проводится в кислой среде при нагревании.
   • Уравнение реакции:
     C6H10O7 (2-кето-L-гулоновая кислота) → C6H8O6 (L-аскорбиновая кислота) + H2O

Метод Рейхштейна, несмотря на свою многостадийность, заложил основу для эффективного крупномасштабного производства витамина С, и его принципы до сих пор используются, хотя и с многочисленными модификациями для повышения экономичности и экологичности процесса.

Сравнительный анализ фармакопейных методов качественного и количественного определения аскорбиновой кислоты

Контроль качества фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов является краеугольным камнем безопасности и эффективности лекарственных средств. Фармакопеи различных стран и регионов регламентируют строгие требования к методам анализа, обеспечивая стандартизацию и воспроизводимость результатов. Аскорбиновая кислота, будучи важным фармацевтическим ингредиентом, также подлежит тщательному контролю.

Методы анализа согласно Государственной фармакопее РФ (ГФ РФ XIV) и Международной фармакопее

Государственная фармакопея Российской Федерации (ГФ РФ XIV издания, ФС.2.1.0058.18) содержит подробные монографии, описывающие требования к аскорбиновой кислоте, включая её описание, методы подтверждения подлинности и количественного определения.

Качественные реакции (подлинность) по ГФ РФ:

• ИК-спектрометрия: Это один из самых надёжных физико-химических методов идентификации. Инфракрасный спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом, должен полностью соответствовать спектру эталонного образца аскорбиновой кислоты. Это подтверждает наличие всех характерных функциональных групп и общую структуру молекулы.
• Спектрофотометрия в УФ-области:
  • Для субстанции: Ультрафиолетовый спектр 0,001% раствора субстанции в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты (кислая среда) в области длин волн от 230 до 300 нм должен иметь максимум поглощения при 243 нм. Удельный показатель поглощения (A^1%_1см) при этом максимуме должен находиться в пределах от 545 до 585.
  • Для растворов для инъекций: УФ-спектры поглощения испытуемого и стандартного растворов в области длин волн от 230 до 300 нм должны иметь максимум при 265 нм в фосфатном буферном растворе pH 7,0 (нейтральная среда). Различие в длине волны максимума поглощения обусловлено изменением ионизации молекулы аскорбиновой кислоты в зависимости от pH.
• Реакция с серебра нитратом (AgNO₃): Это классическая качественная реакция, основанная на восстановительных свойствах аскорбиновой кислоты. К раствору аскорбиновой кислоты прибавляют азотную кислоту и раствор серебра нитрата. В результате восстановления ионов Ag⁺ до металлического серебра (Ag⁰) должен появиться тёмный осадок.
  • Уравнение реакции:
    C6H8O6 + 2AgNO3 → C6H6O6 + 2Ag↓ + 2HNO3
• Реакция с дихлорфенолиндофен��лом натриевой соли: К 0,2 мл испытуемого образца по каплям прибавляют 0,1% раствор дихлорфенолиндофенола натриевой соли в этаноле. Синяя окраска реактива (окисленной формы) должна исчезнуть, так как аскорбиновая кислота восстанавливает его до бесцветной лейкоформы.

Количественное определение по ГФ РФ:

• Титриметрия (метод 1 – Йодиметрия):
  • Принцип: Основан на окислительно-восстановительной реакции, где аскорбиновая кислота (восстановитель) титруется раствором йода (окислителя).
  • Процедура: Титрование 2,0 мл испытуемого образца 0,05 М раствором йода до появления устойчивого синего окрашивания, используя в качестве индикатора 1% раствор крахмала.
  • Уравнение реакции:
    C6H8O6 (аскорбиновая кислота) + I2 (йод) → C6H6O6 (дегидроаскорбиновая кислота) + 2HI (йодоводородная кислота)
    1 мл 0,05 М раствора йода соответствует 0,00881 г C₆H₈O₆.
• Титриметрия (метод 2 – Алкалиметрия):
  • Принцип: Основан на кислотных свойствах аскорбиновой кислоты, которая титруется раствором основания.
  • Процедура: Титрование 2 мл испытуемого раствора 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления розового окрашивания.
  • Индикатор: Используется фенолфталеин, который изменяет окраску в щелочной области pH (pT ≥ 8) до бледно-розовой, устойчивой в течение 30 секунд.
  • Уравнение реакции:
    C6H8O6 (аскорбиновая кислота) + NaOH (гидроксид натрия) → C6H7O6Na (аскорбат натрия) + H2O (вода)
• Йодатометрия:
  • Принцип: Непрямое окислительно-восстановительное титрование. Йодат калия (KIO₃) в кислой среде реагирует с йодидом калия (KI) с образованием элементарного йода, который затем окисляет аскорбиновую кислоту.
  • Процедура: Титрование раствором калия йодата в присутствии хлороводородной кислоты и калия йодида, с крахмалом как индикатором.
  • Уравнения реакций:
    1. KIO3 + 5KI + 6HCl → 6KCl + 3I2 + 3H2O (образование йода)
    2. I2 + C6H8O6 → 2HI + C6H6O6 (реакция йода с аскорбиновой кислотой)
• Индофенольный метод (с 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия):
  • Принцип: 2,6-дихлорфенолиндофенол является обратимым окислителем и цветным индикатором. В окисленной форме он синий, в восстановленной — бесцветный (лейкоформа). Аскорбиновая кислота восстанавливает его.
  • Применение: Используется для объектов, дающих светлоокрашенные экстракты.
  • Окончание титрования: Фиксируется по появлению устойчивой розовой или красной окраски (характерной для окисленной формы реактива в кислой среде) после того, как вся аскорбиновая кислота будет окислена.

Недостатки фармакопейных методов ГФ РФ для ЛРС/ЛРП:

Фармакопейные статьи ГФ РФ, хотя и являются надёжными для чистых субстанций, имеют ряд существенных недостатков при анализе аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном сырье (ЛРС) и лекарственных растительных препаратах (ЛРП):

• Высокая погрешность измерений: В значительной степени обусловлена субъективностью визуальной фиксации точки эквивалентности, особенно в окрашенных извлечениях из ЛРС. Природные красители могут маскировать изменение цвета индикатора, что приводит к неточным результатам.
• Низкая специфичность: Извлечения из ЛРС и ЛРП содержат множество биологически активных веществ, многие из которых обладают восстановительными свойствами (например, полифенолы, флавоноиды, танины, некоторые сахара). Эти соединения могут вступать в реакцию с окислителем-титрантом наравне с аскорбиновой кислотой, приводя к завышенным и неточным результатам.

Методы анализа согласно Фармакопее США (USP) и Европейской фармакопее (Ph. Eur.)

Фармакопея США (USP-NF) и Европейская фармакопея (Ph. Eur.) также содержат детальные монографии для аскорбиновой кислоты (Ph. Eur. монография 0253), устанавливая строгие стандарты для её идентичности, чистоты и количественного содержания.

Определение и требования к чистоте по USP:

• USP определяет аскорбиновую кислоту как водорастворимое незаменимое питательное вещество, широко распространённое в цитрусовых и зелёных овощах. Молекулярная формула C₆H₈O₆, молекулярная масса 176,12 г/моль.
• Согласно монографии USP, аскорбиновая кислота должна содержать не менее 99,0% и не более 100,5% C₆H₈O₆ в пересчёте на сухое вещество, что регламентирует высокую фармацевтическую чистоту (>99,5%).
• В обеих фармакопеях растворы аскорбиновой кислоты также используются в качестве реагентов для проведения других испытаний, что подчёркивает её фундаментальное значение.

Качественные реакции по Европейской фармакопее (Ph. Eur.):

• Ультрафиолетовая и видимая абсорбционная спектрофотометрия (Ph. Eur. 2.2.25):
  • Тестовый раствор (0,10 г аскорбиновой кислоты, растворённый в воде и немедленно разбавленный) должен иметь максимум поглощения при 243 нм. Специфическая абсорбция (удельный показатель поглощения) при этом максимуме должна находиться в диапазоне от 545 до 585. Эти параметры аналогичны требованиям ГФ РФ для кислой среды.
• Инфракрасная абсорбционная спектрофотометрия (Ph. Eur. 2.2.24):
  • Инфракрасный спектр испытуемой субстанции должен быть идентичен спектру химического референтного вещества (CRS) аскорбиновой кислоты. Это подтверждает соответствие молекулярной структуры.
• pH (Ph. Eur. 2.2.3):
  • pH раствора S (1,0 г аскорбиновой кислоты, растворённый в воде, не содержащей углекислого газа, и разбавленный до 20 мл) должен находиться в пределах от 2,1 до 2,6. Это отражает слабокислый характер аскорбиновой кислоты и служит важным параметром контроля её чистоты и стабильности.
• Реакция с нитратом серебра:
  • К 1 мл раствора S добавляют 0,2 мл разбавленной азотной кислоты и 0,2 мл раствора нитрата серебра R2. Образуется серый осадок, что аналогично реакции в ГФ РФ.
  • Принцип: Реакция основана на восстановительной способности аскорбиновой кислоты, которая восстанавливает катионы серебра (Ag⁺) до металлического серебра (Ag⁰), выпадающего в виде кристаллического осадка.
  • Специфичность: Для повышения специфичности реакции на аскорбиновую кислоту рекомендуется проводить её в кислой среде (например, pH 4), хотя восстановление нитрата серебра аскорбиновой кислотой происходит в широком диапазоне pH.

Количественные методы по USP и Ph. Eur.:

• Йодометрическое титрование: Является общепринятым и широко используемым методом количественного определения аскорбиновой кислоты в фармакопеях.
  • Принцип: Метод основан на окислительно-восстановительной реакции, где аскорбиновая кислота окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты раствором йода.
  • Процедура: Образец аскорбиновой кислоты растворяют в свежевскипяченной и охлаждённой воде (для удаления растворённого кислорода, который может окислять аскорбиновую кислоту), добавляют серную кислоту (для поддержания кислой среды, оптимальной для реакции йода с аскорбиновой кислотой и стабильности индикатора) и немедленно титруют 0,1 N раствором йода. В качестве индикатора используется крахмал, который образует интенсивно синий комплекс с избытком йода, сигнализируя об окончании титрования.
  • Расчёт: 1 мл 0,1 N раствора йода эквивалентен 0,008806 г аскорбиновой кислоты.
• Алкалиметрическое титрование: Также используется для определения содержания аскорбиновой кислоты, например, в таблетированных формах.
  • Принцип: Основан на титровании кислотных групп аскорбиновой кислоты раствором основания известной концентрации.
  • Процедура: Образец титруют 0,1 М раствором гидроксида натрия.
  • Индикатор: Согласно фармакопейным требованиям, в качестве индикатора используется фенолфталеин, который изменяет окраску до бледно-розовой в диапазоне pH ≥ 8.

Сравнительный анализ:

Характеристика	ГФ РФ (XIV изд.)	USP (Ph. Eur.)
Чистота	ФС.2.1.0058.18	Не менее 99,0% и не более 100,5% C6H8O6
Качественные реакции	ИК-спектрометрия, УФ-спектрофотометрия (243/265 нм), AgNO3, дихлорфенолиндофенол	ИК-спектрофотометрия, УФ-спектрофотометрия (243 нм), pH (2,1–2,6), AgNO3
Количественные методы	Йодиметрия, Алкалиметрия, Йодатометрия, Индофенольный метод	Йодометрическое титрование, Алкалиметрическое титрование
Индикаторы титрования	Крахмал (йодиметрия/йодатометрия), фенолфталеин (алкалиметрия)	Крахмал (йодометрия), фенолфталеин или метакрезоловый пурпурный (алкалиметрия)
Недостатки для ЛРС	Высокая погрешность из-за окрашенных извлечений, низкая специфичность	Аналогичные проблемы с окрашенными экстрактами и интерференцией в сложных матрицах

Таким образом, фармакопейные методы разных стран демонстрируют значительное сходство в подходах к анализу аскорбиновой кислоты, особенно в отношении титриметрических методов. Однако универсальные методы, разработанные для чистых субстанций, часто оказываются недостаточно специфичными и точными при работе со сложными природными матрицами, такими как лекарственное растительное сырьё, что требует разработки более совершенных и специализированных методик.

Современные инструментальные методы определения аскорбиновой кислоты и их применение

По мере развития аналитической химии появляются всё более изощрённые и точные инструментальные методы, способные преодолевать ограничения классических фармакопейных подходов, особенно при анализе сложных матриц. Эти методы предлагают повышенную чувствительность, селективность и возможность автоматизации.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является одним из наиболее мощных и широко применяемых инструментальных методов для количественного определения аскорбиновой кислоты, особенно в сложных матрицах, таких как лекарственное растительное сырьё (ЛРС) и лекарственные растительные препараты (ЛРП).

• Принцип: Метод основан на разделении компонентов смеси в колонке с неподвижной фазой под воздействием подвижной фазы (элюента). Детектирование целевого аналита (аскорбиновой кислоты) осуществляется на выходе из колонки.
• Аппаратура: Типичная система ВЭЖХ для анализа аскорбиновой кислоты включает:
  • Жидкостный хроматограф: Система насосов, автосамплер, термостат колонки.
  • Диодно-матричный детектор (ДМД): Позволяет регистрировать спектр поглощения аналита по всей длине волны, что обеспечивает высокую специфичность и возможность подтверждения идентичности. Аналитическая длина волны для аскорбиновой кислоты обычно устанавливается на 244 нм.
  • Хроматографическая колонка: Часто используются колонки с обращённо-фазовой неподвижной фазой, например, Inertsil ODS-3. Типичные параметры колонок: размер 250 мм × 4,6 мм с размером частиц 5 мкм или 100 мм × 3,0 мм с размером частиц 3 мкм. ODS (октадецилсилан) означает, что стационарная фаза представляет собой силикагель, модифицированный октадецилсиланом, что обеспечивает гидрофобные взаимодействия.
• Подвижная фаза: В качестве подвижной фазы для определения аскорбиновой кислоты часто используют градиентный режим, состоящий из смеси буферных растворов (например, фосфатный буфер) и органического растворителя (например, метанола или ацетонитрила), что позволяет эффективно разделять аскорбиновую кислоту от других компонентов матрицы.
• Условия пробоподготовки и стабильность: Для обеспечения точности анализа крайне важно ингибировать процессы окисления аскорбиновой кислоты. Надлежащие условия пробоподготовки и хроматографирования, обеспечивающие стабильность раствора на срок не менее 8 часов, включают:
  • Работу в защищённом от света месте.
  • Использование дегазированной воды и растворителей (для удаления растворённого кислорода).
  • Контроль температуры во время пробоподготовки и в автосамплере.
  • Добавление стабилизирующих агентов (например, метафосфорной кислоты, которая подкисляет раствор и хелатирует ионы металлов).
• Преимущества ВЭЖХ:
  • Высокая чувствительность: Позволяет определять низкие концентрации аскорбиновой кислоты.
  • Высокая селективность: Эффективно разделяет аскорбиновую кислоту от интерферирующих веществ в сложных матрицах.
  • Учёт дегидроаскорбиновой кислоты: Методы обращённо-фазовой ВЭЖХ позволяют учитывать содержание дегидроаскорбиновой кислоты, которая является окисленной формой витамина С и также обладает биологической активностью, что даёт более полную картину общего содержания витамина С.
  • Применение: Широко используется для контроля качества ЛРС, продуктов питания, а также для определения витамина С в биологических жидкостях, например, в крови (часто в комбинации с масс-спектрометрией – ВЭЖХ-МС).

Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) является усовершенствованной версией классической тонкослойной хроматографии и также успешно применяется для идентификации и количественного определения аскорбиновой кислоты.

• Принцип: Компоненты смеси разделяются на тонком слое сорбента, нанесённого на пластину, под действием капиллярного движения подвижной фазы. Детекция проводится после разделения.
• Преимущества:
  • Быстрота: Анализ занимает значительно меньше времени по сравнению с ВЭЖХ.
  • Достаточная чувствительность и селективность: При правильном подборе сорбента и подвижной фазы позволяет достичь хороших показателей разделения.
  • Простота анализа: Менее требовательна к аппаратуре и квалификации персонала по сравнению с ВЭЖХ.
  • Экономичность: Низкая стоимость проведения анализа.
• Применение: Используется для скрининга, идентификации и полуколичественного определения аскорбиновой кислоты в различных образцах.

Спектрофотометрические, потенциометрические и флуорометрические методы

Наряду с хроматографическими методами, другие инструментальные подходы также находят применение в анализе аскорбиновой кислоты.

• Спектрофотометрические методы:
  • Принцип: Основаны на измерении поглощения света аналитом в определённой области спектра. Для аскорбиновой кислоты часто используется длина волны 265 нм в нейтральной среде.
  • Применение: Используются для контроля качества препаратов, содержащих аскорбиновую кислоту, а также для исследования объектов, дающих окрашенные экстракты, при условии, что интерферирующие красители не поглощают на той же длине волны.
  • Проблемы: Могут иметь сложности при совместном присутствии аминокислот или других соединений, спектры поглощения которых перекрываются со спектром аскорбиновой кислоты, что приводит к завышенным результатам.
  • Усовершенствованные методы: Разработаны методики, повышающие специфичность, например, спектрофотометрическое определение с использованием соли Fast Blue B (FBSB). Этот метод основан на генерации жёлтого оксалогидразид-2-гидроксибутирил лактонового производного аскорбиновой кислоты.
    • Характеристики: Диапазон линейности: 0–20 мкг/мл; предел обнаружения (ПО): 0,12 мкг/мл; предел количественного определения (ПКО): 0,40 мкг/мл; коэффициент детерминации (R²) > 0,999. Метод показал отсутствие интерференции со стороны сахаров, органических кислот, белков и аминокислот, что делает его высокоспецифичным.
• Потенциометрическое титрование:
  • Принцип: Метод, при котором точка эквивалентности титрования фиксируется по резкому изменению потенциала индикаторного электрода.
  • Применение: Особенно ценен для объектов, дающих окрашенные экстракты, где визуальное определение точки эквивалентности затруднено или невозможно. Позволяет точно фиксировать конец титрования в окислительно-восстановительных реакциях.
  • Пример: Может использоваться для титрования с оксифенилфенилгидразином (ОФФ), который реагирует с дегидроаскорбиновой кислотой, что позволяет определить общее содержание витамина С (аскорбиновая кислота + дегидроаскорбиновая кислота).
• Флуорометрические методы:
  • Принцип: Основаны на измерении интенсивности флуоресценции аналита или его производных.
  • Применение: Высокочувствительны и могут быть применены для объектов, дающих окрашенные экстракты, если сама аскорбиновая кислота или её производные флуоресцируют, а мешающие компоненты – нет.
• Титриметрические методы (инструментализированные):
  • Принцип: Хотя классические титриметрические методы были описаны ранее, их инструментальная модификация позволяет повысить точность.
  • Применение: Используются для прямого титрования окислителей (например, Fe(III), Hg(II), Br₂, I₂) в аналитической химии. Окончание т��трования может определяться не только визуально, но и с помощью фотометрических, кондуктометрических или амперометрических детекторов. Кислотно-основное титрование с использованием 0,1 М раствора NaOH также может быть автоматизировано с потенциометрическим контролем pH.

Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки, и выбор оптимального подхода зависит от конкретной аналитической задачи, типа матрицы, требуемой точности и доступного оборудования.

Проблемы количественного определения аскорбиновой кислоты в растительных продуктах и принципы разработки новых методик

Определение аскорбиновой кислоты в чистых субстанциях или простых растворах относительно прямолинейно, но при переходе к сложным природным матрицам, таким как растительные продукты, возникают многочисленные аналитические вызовы. Эти проблемы требуют разработки специализированных и надёжных методик.

Специфические проблемы анализа в растительных матрицах

Лекарственное растительное сырьё (ЛРС) и лекарственные растительные препараты (ЛРП) представляют собой комплексные системы, содержащие тысячи различных соединений, что делает количественное определение одного компонента, такого как аскорбиновая кислота, особенно сложным.

• Высокая погрешность измерений, связанная с визуальным титрованием:
  • Субъективность: Классические титриметрические методы, включённые в фармакопейные статьи ГФ РФ, часто полагаются на визуальную фиксацию точки эквивалентности по изменению цвета индикатора. В окрашенных извлечениях из ЛРС природные пигменты (например, хлорофиллы, антоцианы, каротиноиды) могут маскировать или изменять цвет индикатора, делая визуальное определение точки эквивалентности крайне субъективным и неточным. Это приводит к высокой погрешности измерений и низкой воспроизводимости результатов.
  • Пример: Определение витамина С в плодах шиповника, содержащих красные антоциановые пигменты, с помощью йодометрического титрования может быть затруднено из-за перекрывания красного цвета экстракта с синим цветом йод-крахмального комплекса.
• Низкая специфичность из-за интерференции других веществ:
  • Многокомпонентность: Извлечения из ЛРС и ЛРП содержат множество биологически активных веществ, многие из которых обладают восстановительными свойствами, аналогичными аскорбиновой кислоте. К таким веществам относятся полифенолы (например, флавоноиды, танины, фенолкарбоновые кислоты), некоторые аминокислоты, сахара и другие органические соединения.
  • Перекрёстные реакции: Эти интерферирующие соединения могут вступать в реакции с окислителем-титрантом (например, йодом или 2,6-дихлорфенолиндофенолом) наравне с аскорбиновой кислотой. В результате регистрируется «кажущееся» высокое содержание аскорбиновой кислоты, что приводит к завышенным результатам и не позволяет объективно оценить реальное количество витамина С.
• Ключевая проблема: нестабильность аскорбиновой кислоты:
  • Чувствительность к внешним факторам: Аскорбиновая кислота является чрезвычайно нестабильным соединением. Её водные растворы очень чувствительны к воздействию света, кислорода воздуха, повышенной температуры и изменению pH.
  • Катализ ионами металлов: Особую опасность представляют ионы металлов, особенно ионы меди (Cu²⁺) и железа (Fe³⁺), которые являются сильными катализаторами окисления аскорбиновой кислоты. В растительных экстрактах эти ионы могут присутствовать в следовых количествах, но их каталитическое действие значительно ускоряет разложение витамина С даже в процессе пробоподготовки и анализа. Это требует использования хелатирующих агентов и строжайшего контроля за чистотой реагентов и посуды.
  • Влияние на результаты: Неконтролируемое разложение аскорбиновой кислоты во время подготовки образца и проведения анализа приводит к систематической ошибке и занижению реального содержания.
• Ограничения стандартизованных спектрофотометрических методов:
  • Стандартизованные спектрофотометрические методы, хотя и являются инструментальными, могут давать статистически значимо отличающиеся результаты от сертифицированных значений. Это связано с тем, что многие из них измеряют только восстановленную форму аскорбиновой кислоты, не учитывая содержание дегидроаскорбиновой кислоты. При этом дегидроаскорбиновая кислота, хотя и является продуктом окисления, также обладает биологической активностью, и её включение в общий показатель витамина С важно для полной оценки.

Принципы разработки новых методик

Учитывая вышеизложенные проблемы, разработка новых, более совершенных методик количественного определения аскорбиновой кислоты в растительных продуктах является насущной необходимостью. Эти методики должны быть высокоспецифичными, точными, воспроизводимыми и устойчивыми к интерференции.

Основные принципы разработки:

1. Подбор оптимальных условий испытаний и получение стабильных растворов:
   • Минимизация контакта с кислородом: Использование свежевскипяченной и охлаждённой дегазированной воды, работа в атмосфере инертного газа (азот, аргон).
   • Защита от света: Проведение всех этапов пробоподготовки и анализа в защищённом от света месте, использование тёмной посуды.
   • Контроль температуры: Работа при пониженных температурах (например, в холодильнике или на ледяной бане).
   • Стабилизация pH: Поддержание оптимального для стабильности аскорбиновой кислоты pH (например, добавление метафосфорной кислоты, которая подкисляет раствор и одновременно является хелатирующим агентом для ионов металлов).
   • Использование хелатирующих агентов: Добавление ЭДТА или других комплексообразователей для связывания ионов металлов (Cu, Fe), катализирующих окисление.
2. Разработка методик, учитывающих специфику объекта (ЛРС, ЛРП):
   • Предварительная пробоподготовка: Для сложных окрашенных экстрактов может потребоваться стадия предварительной очистки. Это включает:
     • Сорбция окрашенных соединений: Для титриметрических методов в окрашенных экстрактах можно использовать предварительную сорбцию мешающих окрашенных соединений (например, на каолине, активированном угле, или с помощью специализированных картриджей для твёрдофазной экстракции). Это позволяет получить более светлые извлечения, что упрощает визуальное определение точки эквивалентности или повышает точность инструментальных методов.
     • Экстракция: Оптимизация растворителя и условий экстракции для максимального извлечения аскорбиновой кислоты с минимальным количеством интерферирующих веществ.
3. Разработка высокочувствительных и селективных инструментальных методик:
   • ВЭЖХ: Является золотым стандартом для анализа аскорбиновой кислоты в сложных матрицах. Разработка ВЭЖХ-методик с диодно-матричным детектированием или масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) позволяет достичь максимальной селективности, чувствительности и точности. Эти методы способны не только разделять аскорбиновую кислоту от других восстановителей, но и определять её окисленную форму — дегидроаскорбиновую кислоту, что даёт полное представление о содержании витамина С.
   • ВЭТСХ: При правильном подходе может быть использована для идентификации и полуколичественного анализа, а также для скрининга.
   • Электрохимические методы: Вольтамперометрия и другие электрохимические методы могут быть высокоселективными и чувствительными для определения аскорбиновой кислоты, особенно при использовании модифицированных электродов.
   • Спектрофотометрия с повышенной специфичностью: Использование реагентов, образующих специфические комплексы с аскорбиновой кислотой (например, с солью Fast Blue B), позволяет минимизировать интерференцию.

Применение этих принципов позволяет создать надёжные и валидированные аналитические методики, способные объективно и точно определять содержание аскорбиновой кислоты даже в самых сложных растительных матрицах, что является критически важным для стандартизации качества лекарственного растительного сырья и пищевых продуктов.

Этапы разработки и валидации нового метода количественного анализа аскорбиновой кислоты в растительном сырье

Разработка нового аналитического метода — это многоступенчатый процесс, требующий систематического подхода и тщательного документирования. Кульминацией этого процесса является валидация, которая подтверждает пригодность методики для конкретной аналитической задачи. Для определения аскорбиновой кислоты в растительном сырье, где присутствует множество интерферирующих факторов и высока нестабильность аналита, валидация приобретает особое значение.

Основные валидационные параметры

Валидация методики определения аскорбиновой кислоты включает оценку ряда ключевых параметров, которые гарантируют её надёжность и применимость:

1. Специфичность (Specificity):
   • Определение: Способность методики однозначно определять аналит (аскорбиновую кислоту) в присутствии других компонентов матрицы (растительного экстракта), таких как полифенолы, флавоноиды, сахара, аминокислоты и их продукты распада.
   • Оценка: Проводится путём анализа образцов, содержащих аналит в чистом виде, с добавлением известных интерферирующих веществ и в матрице без аналита. Хроматографические методы (ВЭЖХ, ВЭТСХ) демонстрируют высокую специфичность за счёт разделения компонентов. Для спектрофотометрических методов специфичность может быть повышена за счёт использования специфических реагентов.
2. Линейность (Linearity):
   • Определение: Способность аналитической методики давать результаты, которые прямо пропорциональны концентрации аналита в образце в заданном диапазоне.
   • Оценка: Осуществляется путём приготовления серии растворов с различными, точно известными концентрациями аналита (не менее 5 различных уровней концентрации) в пределах предполагаемого рабочего диапазона. Строится калибровочная кривая (например, зависимость площади пика от концентрации).
   • Критерий приемлемости: Коэффициент корреляции (R²) должен быть не менее 0,995.
3. Предел обнаружения (Limit of Detection, ПО или LOD):
   • Определение: Минимальное количество или концентрация аналита в образце, которое может быть обнаружено, но не обязательно количественно определено с заданной точностью и прецизионностью.
   • Расчёт: ПО может быть рассчитан по формуле:
     ПО = 3,3 · (SD / S)
     где SD — стандартное отклонение отклика (например, площади пика) для холостого образца или низкоконцентрированного образца; S — наклон калибровочной кривой.
4. Предел количественного определения (Limit of Quantitation, ПКО или LOQ):
   • Определение: Минимальное количество или концентрация аналита в образце, которое может быть количественно определено с приемлемой точностью и прецизионностью.
   • Расчёт: ПКО может быть рассчитан по формуле:
     ПКО = 10 · (SD / S)
     где SD и S имеют те же значения, что и для ПО.
5. Повторяемость (Repeatability) / Прецизионность (Precision):
   • Определение: Близость результатов, полученных при многократном анализе одной и той же однородной пробы в идентичных условиях (один аналитик, одно оборудование, одна лаборатория, короткий промежуток времени). Это показатель случайных ошибок.
   • Оценка: Проводится путём многократного (не менее 6) анализа одного и того же образца.
   • Количественное выражение: Повторяемость выражается как относительное стандартное отклонение (RSD, в процентах).
   • Критерий приемлемости: Для количественных методов определения основной субстанции RSD не должен превышать 2%.
6. Правильность (Accuracy) / Точность (Trueness):
   • Определение: Степень соответствия между средним значением, полученным в серии измерений, и истинным (или принятым за истинное) значением. Это показатель систематических ошибок.
   • Оценка: Обычно оценивается как процент извлечения (recovery) или процент отклонения от истинного значения. Проводится путём анализа образцов с добавлением известного количества аналита (метод «добавок»).
   • Критерий приемлемости: Для фармацевтических субстанций процент извлечения обычно должен находиться в диапазоне 98,0–102,0%.
7. Эффективность (Robustness): Способность метода оставаться нечувствительным к небольшим, но преднамеренным изменениям параметров метода (например, pH подвижной фазы, температура колонки, концентрация реагентов), что демонстрирует его надёжность в различных условиях.

Процедуры разработки и апробации

Разработка нового метода анализа аскорбиновой кислоты в растительном сырье начинается с тщательного подбора условий и заканчивается его практической апробацией:

1. Подбор условий экстракции:
   • Выбор растворителя (например, вода, водные растворы метафосфорной кислоты, уксусной кислоты) для эффективного извлечения аскорбиновой кислоты с минимальным количеством мешающих веществ.
   • Оптимизация температуры и времени экстракции.
   • Механическое воздействие (измельчение, гомогенизация, ультразвуковая обработка) для повышения эффективности извлечения.
2. Очистка образца:
   • Применение методов предварительной очистки для удаления окрашенных соединений и других интерферентов. Это может включать сорбцию на каолине, активированном угле, использование твёрдофазной экстракции (ТФЭ) или осаждение белков.
   • Фильтрация через мембранные фильтры (например, с размером пор 0,45 мкм) для удаления твёрдых частиц перед инструментальным анализом.
3. Оптимизация хроматографических или других параметров:
   • Для ВЭЖХ: Подбор типа и размера колонки, состава и градиента подвижной фазы, скорости потока, температуры колонки, длины волны детектирования. Цель — достижение оптимального разделения пиков аскорбиновой кислоты от пиков интерферентов, хорошей формы пика и минимального времени анализа.
   • Для спектрофотометрии: Выбор длины волны, концентрации реагентов, времени реакции.
4. Обеспечение стабильности раствора аскорбиновой кислоты:
   • Как упоминалось ранее, крайне важно проводить все этапы пробоподготовки и анализа в условиях, минимизирующих разложение аскорбиновой кислоты:
     • Работа в защищённом от света месте.
     • Использование дегазированной воды и растворителей.
     • Контроль температуры (хранение растворов при низких температурах).
     • Подкисление растворов (например, 0,1 М раствором метафосфорной кислоты), что не только стабилизирует аскорбиновую кислоту, но и часто хелатирует ионы металлов.
   • Надлежащие условия пробоподготовки и хроматографирования должны обеспечивать стабильность раствора аскорбиновой кислоты на срок не менее 8 часов, достаточный для проведения серии анализов.
5. Апробация разработанных методов:
   • Проведение испытаний нового метода на реальных образцах лекарственного растительного сырья. В качестве примеров могут быть использованы:
     • Листья крапивы двудомной (Urtica dioica).
     • Плоды облепихи крушиновидной (Hippophaë rhamnoides).
     • Плоды шиповника (Rosa canina).
   • Сравнение полученных результатов с данными, полученными другими валидированными методами (например, референтными методами), для подтверждения правильности.

Таким образом, комплексная разработка и валидация метода гарантирует, что полученные данные о содержании аскорбиновой кислоты в растительных продуктах будут достоверными, точными и пригодными для принятия решений в области контроля качества и стандартизации. Если метод не валидирован, то как можно доверять его результатам?

Заключение

Аскорбиновая кислота, или витамин С, является краеугольным камнем метаболизма человека, выполняя критически важные функции от антиоксидантной защиты до синтеза коллагена и иммуномодуляции. Её химическая нестабильность и чувствительность к внешним факторам, таким как свет, температура, кислород и ионы металлов, представляют собой постоянный вызов как для сохранения пищевой ценности продуктов, так и для её точного аналитического определения. Промышленный синтез аскорбиновой кислоты, основанный на элегантном сочетании химических и биотехнологических процессов, как, например, в классическом методе Рейхштейна, обеспечил массовое производство этого жизненно важного соединения.

Проведённый сравнительный анализ фармакопейных методов (ГФ РФ, USP, Ph. Eur., Международная фармакопея) выявил общие подходы к качественному (ИК- и УФ-спектрофотометрия, реакции с нитратом серебра) и количественному (йодометрия, алкалиметрия) определению аскорбиновой кислоты. Однако, несмотря на их надёжность для чистых субстанций, было чётко показано, что для сложных растительных матриц эти методы демонстрируют существенные недостатки. Главными из них являются высокая погрешность, обусловленная субъективностью визуальной фиксации т��чки эквивалентности в окрашенных экстрактах, и низкая специфичность из-за интерференции многочисленных биологически активных веществ (полифенолов, флавоноидов, сахаров), обладающих восстановительными свойствами.

Эти ограничения обуславливают острую необходимость в разработке и внедрении новых, более совершенных аналитических методик. Современные инструментальные методы, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ), а также усовершенствованные спектрофотометрические и потенциометрические подходы, предлагают значительно более высокую чувствительность, селективность и точность. ВЭЖХ, в частности, выделяется своей способностью не только разделять аскорбиновую кислоту от интерферентов, но и учитывать содержание дегидроаскорбиновой кислоты, предоставляя наиболее полную картину общего витамина С.

Разработка нового метода количественного анализа аскорбиновой кислоты в растительном сырье должна базироваться на строгом следовании принципам аналитической валидации. Оценка таких параметров, как предел обнаружения, предел количественного определения, специфичность, линейность, повторяемость и правильность, является неотъемлемой частью процесса. При этом критически важным является подбор оптимальных условий пробоподготовки (защита от света, кислорода, контроль pH и температуры, использование стабилизирующих и хелатирующих агентов) и применение методов предварительной очистки (например, сорбция каолином) для минимизации интерференции и деградации аналита. Апробация разработанных методов на таких примерах, как листья крапивы, плоды облепихи и шиповника, подтверждает их практическую применимость и эффективность.

Таким образом, проделанная работа подчёркивает не только фундаментальное значение аскорбиновой кислоты, но и актуальность непрерывного совершенствования аналитических подходов. Разработанный и валидированный метод количественного анализа аскорбиновой кислоты в растительных матрицах представляет собой значительный вклад в решение существующих проблем, предлагая надёжный инструмент для контроля качества лекарственного растительного сырья и пищевых продуктов. Его потенциал для практического применения в фармацевтической и пищевой промышленности огромен, обеспечивая точную оценку содержания витамина С и способствуя повышению стандартов безопасности и эффективности продукции.

Список использованной литературы

1. Аксенова Э.Н., Арзамасцев В.Н. Фармацевтическая химия. М.: Гэотар, 2001. 456 с.
2. Полинг Л., Полинг П. Химия. М.: Мир, 1978. 678 с.
3. Чичибабин А.Е. Основные начала органической химии. Т.1,2. М.: Госхимиздат, 1957.
4. Воробьева Л.И. Микробиологический синтез витаминов. М.: Изд. МГУ, 1982. 168 с.
5. Международная фармакопея. Т.1,2,3. Женева, 1983.
6. Государственная фармакопея. ГФ XII.
7. Фармакопея США. URL: http://www.gmp-club.com/ru/links/pharmacopeians.html (дата обращения: 27.10.2025).
8. Лира О.А. Совершенствование фармацевтического анализа лекарственных средств ряда кислот и оснований с помощью гальваностатической кулонометрии: автореф. дис. канд. фарм. наук. М., 2011.
9. Витамин C (аскорбиновая кислота). «Моя Наука»: медицинские центры в Самаре, Ульяновске, Оренбурге и сеть клинико-диагностических лабораторий. URL: https://www.moyanauka.ru/patients/analizy/vitamin-c-askorbinovaya-kislota/ (дата обращения: 27.10.2025).
10. Витамин С (аскорбиновая кислота): что это такое, и для чего организму нужно? Consumed. URL: https://consumed.ru/articles/vitamin-s-askorbinovaya-kislota-chto-eto-takoe-i-dlya-chego-organizmu-nuzhno (дата обращения: 27.10.2025).
11. Метод определения количественного содержания аскорбиновой кислоты (витамина С). КоролевФарм. URL: https://korolevfarm.ru/knowledge/metod_opredeleniya_kolichestvennogo_soderzhaniya_askorbinovoy_kisloty_vitamina_s/ (дата обращения: 27.10.2025).
12. Аскорбиновая кислота. РУВИКИ. URL: https://ru.ruwiki.ru/wiki/%D0%90%D1%81%D0%BA%D0%BE%D1%80%D0%B1%D0%B8%D0%BD%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D1%8F_%D0%BA%D0%B8%D1%81%D0%BB%D0%BE%D1%82%D0%B0 (дата обращения: 27.10.2025).
13. Витамин С (аскорбиновая кислота, антицинготный). Биологическая химия. Биохимия. URL: https://medbiol.ru/medbiol/biochem/00045f8a.htm (дата обращения: 27.10.2025).
14. Витамин С (аскорбиновая кислота): для чего полезен, как принимать и в каких продуктах содержится? Эвалар. URL: https://evalar.ru/articles/vitamin-c/ (дата обращения: 27.10.2025).
15. Витамин C, или аскорбиновая кислота. Tervisliku toitumise informatsioon. Toitumine.ee. URL: https://toitumine.ee/energia-ja-toitainete-vajadus/vitamiinid/vitamiin-c-ehk-askorbiinhape (дата обращения: 27.10.2025).
16. Аскорбиновая кислота в промышленности, химические свойства. ООО «РоссПолимер». URL: https://ross-polimer.ru/blog/askorbinovaya-kislota-v-promyshlennosti-khimicheskie-stvoystva/ (дата обращения: 27.10.2025).
17. Спектрофотометрическое определение аскорбиновой кислоты и аминокислот при совместном присутствии. КиберЛенинка. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/spektrofotometricheskoe-opredelenie-askorbinovoy-kisloty-i-aminokislot-pri-sovmestnom-prisutstvii (дата обращения: 27.10.2025).
18. Определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах методом ВЭЖХ. Голомазова. URL: https://pharmjournal.ru/article/2607-0638/2023/5/11/opredelenie-askorbinovoy-kisloty-v-lekarstvennykh-rastitelnykh-preparatakh-metodom-vezhkh (дата обращения: 27.10.2025).
19. Аскорбиновая кислота. Primelab. URL: https://www.primelab.ru/catalog/khimicheskie-reaktivy-primelab/askorbinovaya-kislota/ (дата обращения: 27.10.2025).
20. Валидация методики определения аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Voronezh State University Scientific Journals. Воронежский государственный университет. URL: https://journals.vsu.ru/sorb/article/view/2157 (дата обращения: 27.10.2025).
21. Валидация методики определения аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Сорбционные и хроматографические процессы. Воронежский государственный университет. URL: https://www.sorb.vsu.ru/article/view/2157 (дата обращения: 27.10.2025).
22. Определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах методом ВЭЖХ. КиберЛенинка. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/opredelenie-askorbinovoy-kisloty-v-lekarstvennyh-rastitelnyh-preparatah-metodom-vezhkh (дата обращения: 27.10.2025).
23. Валидация методики определения аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии. ResearchGate. URL: https://www.researchgate.net/publication/322989108_Validacia_metodiki_opredelenia_askorbinovoj_kisloty_metodom_vysokoeffektivnoj_tonkoslojnoj_hromatografii (дата обращения: 27.10.2025).
24. RU2696865C1 — Способ количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных средствах. Google Patents. URL: https://patents.google.com/patent/RU2696865C1/ru (дата обращения: 27.10.2025).
25. Особенности определения аскорбиновой кислоты в витаминно-минеральном комплексе Gesticare. URL: https://health-ua.com/pics/pdf/ZU_2015_04_farm_12.pdf (дата обращения: 27.10.2025).
26. Определение количественного содержания аскорбиновой кислоты в раст. Karaganda Buketov University. URL: https://article.ksu.kz/jour/article/download/123/123/ (дата обращения: 27.10.2025).
27. Определение содержания аскорбиновой кислоты в продуктах питания. Nubex.ru. URL: https://nubex.ru/upload/iblock/c31/c3196f30f5d475ce3b44b80e8e9ae6ad.pdf (дата обращения: 27.10.2025).
28. Определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных преп. ResearchGate. URL: https://www.researchgate.net/publication/372791836_Opredelenie_askorbinovoj_kisloty_v_lekarstvennyh_rastitelnyh_preparatah_metodom_VEZHH (дата обращения: 27.10.2025).
29. Аскорбиновая кислота. Pharmacopoeia.ru. URL: https://pharmacopoeia.ru/fs-2-1-0058-18-askorbinovaya-kislota/ (дата обращения: 27.10.2025).
30. Аскорбиновая кислота — описание вещества, фармакология, применение, противопоказания, формула. РЛС. URL: https://www.rlsnet.ru/active-substance/askorbinovaya-kislota (дата обращения: 27.10.2025).
31. EA009287B1 — Получение l-аскорбиновой кислоты в результате микробиологического процесса. Google Patents. URL: https://patents.google.com/patent/EA009287B1/ru (дата обращения: 27.10.2025).
32. МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ТИТРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА С В ОКРАШЕННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТАХ. КиберЛенинка. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/modifitsirovannyy-titrimetricheskiy-metod-kolichestvennogo-opredeleniya-vitamina-s-v-okrashennyh-rastitelnyh-ekstraktah (дата обращения: 27.10.2025).
33. Аскорбиновая кислота. Синтез (методика) русский cтраница 1. Allbest.ru. URL: https://www.allbest.ru/o-2c0a655b5b2bd69a5d43b8852136b328.html (дата обращения: 27.10.2025).
34. Курсовая работа: Технология производства аскорбиновой кислоты (витамина С). Bestreferat.ru. URL: https://www.bestreferat.ru/referat-247960.html (дата обращения: 27.10.2025).
35. Альтернативные пути синтеза витамина C: Биотехнологический подход. Ai Mitup. URL: https://aimitup.com/blog/alternativnye-puti-sinteza-vitamina-c-biotekhnologicheskii-podkhod (дата обращения: 27.10.2025).
36. Аскорбиновая кислота (витамин C). Аквилон. URL: https://aqvelon.ru/catalog/askorbinovaya-kislota/ (дата обращения: 27.10.2025).
37. Методы синтеза и технология производства лекарственных средств. Химико-фармацевтический журнал. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=17978643 (дата обращения: 27.10.2025).
38. Витамин С (аскорбиновая кислота) – сдать анализы в Санкт-Петербурге, цены в медицинской лаборатории Хеликс. URL: https://helix.ru/kb/item/08-111 (дата обращения: 27.10.2025).
39. Аскорбиновая кислота. Pharmacopoeia.ru. URL: https://pharmacopoeia.ru/askorbinovaya-kislota-2/ (дата обращения: 27.10.2025).
40. Аскорбиновая кислота. Синтез (методика). Способы качественного и количественного анализа в фармакопеях разных стран с приведением методик. Разработка нового метода количественного определения аскорбиновой кислоты. Yurii.ru. URL: https://yurii.ru/farmacevticheskaya-himiya/askorbinovaya-kislota-sintez-metodika-sposoby-kachestvennogo-i-kolichestvennogo-analiza-v-farmakopeyah-raznyh-stran-s-privedeniem-metodik-razrabotka-novogo-metoda-kolichestvennogo-opredeleniya-askorbinovoy-kisloty (дата обращения: 27.10.2025).
41. ФС.3.6.0003. Фармакопейная статья. Аскорбиновой кислоты 1% раствор» (утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 11.04.2025 N 188) («Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание»). URL: https://docs.cntd.ru/document/420427814 (дата обращения: 27.10.2025).
42. USP Ascorbic Acid 50-81-7 L-Ascorbic acid. Echemi. URL: https://www.echemi.com/products/pid_50-81-7-cas-l-ascorbic-acid.html (дата обращения: 27.10.2025).
43. European Pharmacopoeia Ascorbic acid solution. TLC-Lab. URL: https://www.tlc-lab.com/analytical-standards/european-pharmacopoeia/european-pharmacopoeia-ascorbic-acid-solution-1093714 (дата обращения: 27.10.2025).
44. Assay of ascorbic acid by iodometric titration method. Dr. Meenaxi Maste. YouTube. URL: https://www.youtube.com/watch?v=F_fP7u8y71M (дата обращения: 27.10.2025).
45. USP-NF. URL: https://www.usp.org/usp-nf (дата обращения: 27.10.2025).
46. Determining Ascorbic Acid in Vitamin C Tablets. YouTube. URL: https://www.youtube.com/watch?v=YfL1xM61S1k (дата обращения: 27.10.2025).
47. Analysis of ascorbic acid (Chemistry Laboratory Previews). YouTube. URL: https://www.youtube.com/watch?v=2r11M4J4e3k (дата обращения: 27.10.2025).
48. Acid Ascorbic. Scribd. URL: https://www.scribd.com/document/500647463/Acid-Ascorbic (дата обращения: 27.10.2025).
49. Ascorbic Acid — Definition, Characters. British Pharmacopeia 2025. URL: https://www.pharmacopoeia.com/bp-2025/monographs/ascorbic-acid.html (дата обращения: 27.10.2025).