Сравнительный анализ лабораторных методов количественной оценки антиоксидантной активности лекарственных препаратов: Химические принципы, стандарты и критический обзор

Введение: Актуальность проблемы окислительного стресса и цели работы

В последние десятилетия интерес к антиоксидантам (АО) в фармацевтической и клинической практике многократно возрос. Этот класс соединений рассматривается как ключевой фактор в защите организма от разрушительного действия окислительного стресса — дисбаланса между продукцией активных форм кислорода (АФК, или ROS) и способностью биологической системы нейтрализовать их или восстанавливать вызванные ими повреждения. Окислительный стресс является не просто сопутствующим фактором, а фундаментальным патогенетическим звеном в развитии широкого спектра тяжелых заболеваний, включая нейродегенеративные патологии (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона) и сердечно-сосудистые нарушения.

С учетом стратегической важности антиоксидантов как класса лекарственных препаратов (ЛП), критически необходимо разработать и применять точные, воспроизводимые и информативные лабораторные методы для количественной оценки их активности. Эффективность препарата, заявленного как антиоксидант, напрямую зависит от его способности связывать свободные радикалы или инактивировать активные формы кислорода.

Целью данной работы является всесторонний обзор и компаративный анализ ключевых лабораторных методов, используемых в современной фармацевтической химии для оценки антиоксидантной активности. Мы проанализируем химические принципы, преимущества и критические ограничения методов, включая спектрофотометрические (DPPH, FRAP, ABTS), флуориметрические (ORAC), хемилюминесцентные и электрохимические подходы, а также рассмотрим стандартизированные количественные показатели, необходимые для выражения результатов в академической и практической фармации.

Структура работы построена на последовательном переходе от теоретических биохимических основ антиоксидантной защиты к детальному, критически осмысленному анализу инструментальных методик, что соответствует требованиям к глубокому теоретическому исследованию в рамках курсовой работы.

Теоретические основы антиоксидантной защиты и классификация веществ

Биохимический механизм действия: от свободных радикалов до патогенеза

Антиоксиданты (АО) определяются как вещества, которые в физиологически значимых концентрациях способны взаимодействовать с реактогенными окислителями, активными формами кислорода (ROS) и другими свободными радикалами, инактивируя их или предотвращая их образование.

Свободный радикал — это молекула или атом, имеющий неспаренный электрон на внешней орбитали, что делает его крайне реактивным. Ключевыми представителями ROS (Активных Форм Кислорода) радикальной и нерадикальной природы являются супероксидный анион-радикал (O₂•⁻), гидроксильный радикал (HO•), перекись водорода (H₂O₂) и синглетный кислород (O₂).

Нарушение баланса между продукцией ROS и системой антиоксидантной защиты организма приводит к окислительному стрессу. В этом состоянии ROS атакуют критически важные биомолекулы. Это проявляется в:

1. Перекисном окислении липидов (ПОЛ): Разрушение клеточных мембран, что ведет к нарушению их проницаемости и функции.
2. Повреждении ДНК: Мутации, ведущие к нарушению генетического аппарата клетки.
3. Дисфункции митохондрий: Нарушение энергетического обмена и усиление генерации ROS, поскольку митохондрии являются основным источником АФК.

Детализация патогенеза: В контексте нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, окислительный стресс играет центральную роль. Накопление ROS в нервной ткани вызывает агрегацию патологических белков (например, бета-амилоида), повреждение нейронов и необратимую дегенерацию. Таким образом, количественная оценка АОА лекарственных препаратов направлена на прогнозирование их способности прерывать эти патологические цепные реакции, что, несомненно, является критически важным для разработки эффективной терапии.

Классификация антиоксидантных лекарственных средств

Антиоксидантные лекарственные средства классифицируются по нескольким критериям, что важно для понимания механизмов их действия и выбора аналитической методики.

1. По происхождению:

• Эндогенные: Соединения, вырабатываемые организмом (например, $\alpha$-токоферол (витамин E), аскорбиновая кислота (витамин С), глутатион).
• Синтетические: Созданные в лабораторных условиях ЛС, часто являющиеся структурными аналогами или имитаторами природных АО (например, Эмоксипин, Димексид, Гипоксен).
• Ферментативные и их активаторы: Белки, катализирующие нейтрализацию радикалов (например, супероксиддисмутаза, каталаза) или их синтетические имитаторы.

2. По механизму действия (аналитический аспект):

• Обрыватели цепей (радикальные ловушки): Реагируют непосредственно со свободными радикалами (ROO•, RO•), превращая их в стабильные продукты и прерывая цепную реакцию. Эти АО часто оцениваются методами, основанными на прямом взаимодействии с радикалами (DPPH, ABTS).
• Комплексообразователи (хелаторы): Связывают ионы переходных металлов (Fe²⁺, Cu⁺), которые выступают катализаторами свободно-радикальных реакций. Оценка хелатирующей способности требует отдельных методик.
• Восстановители: Непосредственно нейтрализуют активные формы кислорода и восстанавливают окисленные субстраты. Эти свойства лежат в основе методов, оценивающих восстановительную силу (например, FRAP).

Особое внимание уделяется перспективным направлениям, таким как синтез серасодержащих антиоксидантов (например, тиоктовая кислота, пробукол), поскольку сера легко окисляется и способна эффективно связывать катионы тяжелых металлов, повышая функциональную АОА. Именно благодаря этому свойству они демонстрируют высокую эффективность в детоксикации и защите митохондрий.

Спектрофотометрические и флуориметрические методы: Основные подходы и их критические ограничения

Спектрофотометрические методы являются наиболее распространенными, доступными и часто используемыми для первоначальной оценки антиоксидантной активности, особенно в фармацевтическом анализе растительного сырья и готовых форм.

Методы, основанные на переносе электрона (SET) и атома водорода (HAT)

Большинство фотометрических методов основаны на реакции антиоксиданта с устойчивым окрашенным радикалом, что приводит к обесцвечиванию раствора, регистрируемому спектрофотометрически. Эти методы в основном оценивают способность АО восстанавливать или нейтрализовать радикал либо путем переноса атома водорода (Hydrogen Atom Transfer, HAT), либо путем переноса одного электрона (Single Electron Transfer, SET).

Метод	Химический принцип	Длина волны регистрации	Преимущества
DPPH	Восстановление пурпурного радикала до стабильной желтой молекулы (смешанный HAT/SET).	514 нм	Быстрота, простота, доступность реагента.
FRAP	Восстановление комплекса Fe³⁺-трипиридилтриазин до Fe²⁺ (преимущественно SET).	593 нм	Оценка восстановительной силы, высокая чувствительность.
ABTS	Ингибирование обесцвечивания зелено-голубого катион-радикала ABTS•⁺ (смешанный HAT/SET).	743 нм	Может использоваться как в водных, так и в органических средах.

Метод DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил): Этот метод основан на реакции АО с окрашенным стабильным радикалом DPPH•, который имеет максимум поглощения при 514 нм. При взаимодействии с антиоксидантом радикал восстанавливается, происходит снижение оптической плотности, что прямо пропорционально антирадикальной активности образца.

Критический момент, часто игнорируемый в упрощенных обзорах, заключается в том, что реакция DPPH не является чистым HAT или SET. Она представляет собой смешанный процесс, где соотношение механизмов зависит от полярности растворителя и структуры антиоксиданта.

Применение полярных растворителей (например, метанола, этанола) и наличие ионизирующихся групп в молекуле АО (например, фенольных гидроксилов) часто смещает равновесие в сторону более быстрого механизма SET. Это означает, что результаты, полученные с DPPH, отражают не только способность отдавать водород, но и способность отдавать электрон.

Метод FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power): Метод оценивает восстановительную силу антиоксидантов. В кислой среде (низкий pH) антиоксиданты восстанавливают комплекс трехвалентного железа (Fe³⁺) с трипиридилтриазином до интенсивно окрашенного комплекса двухвалентного железа (Fe²⁺). Измерение оптической плотности при 593 нм дает оценку суммарной восстановительной мощности образца.

Метод ABTS (2,2′-азино-бис(3-этилбензтиазолино-6-сульфоновая кислота)): В этом методе зелено-голубой катион-радикал ABTS•⁺ генерируется путем неферментативного окисления водного раствора ABTS, чаще всего с использованием персульфата калия (K₂S₂O₈) с последующей длительной инкубацией (12–16 ч) в темноте. Антиоксидантная активность оценивается по способности образца обесцвечивать этот радикал (ABTS•⁺ поглощает при 743 нм).

Критический анализ метода ORAC (Oxygen Radical Absorption Capacity)

Метод ORAC (флуориметрический) основан на измерении степени ингибирования антиоксидантом окислительного эффекта кислородных радикалов. В стандартной процедуре, радикалы (часто пероксильные, генерируемые термическим разложением азосоединений, например AAPH) атакуют флуоресцентный зонд (например, флуоресцеин), вызывая снижение его интенсивности флуоресценции. Антиоксидант замедляет или предотвращает это снижение, и площадь под кривой флуоресценции отражает общую способность образца поглощать кислородные радикалы.

Критическое ограничение и статус ORAC. Несмотря на то, что ORAC оценивает активность АО к физиологически релевантным пероксильным радикалам и ранее считался тестом первого уровня, его статус был пересмотрен. AOAC INTERNATIONAL (Ассоциация официальных аналитических химиков/сотрудничества) исключила ORAC из списка стандартных методов, предназначенных для коммерческого маркирования продуктов. Основные причины такого решения — плохая воспроизводимость результатов между лабораториями, высокая сложность процедуры, продолжительность анализа и значительная стоимость оборудования (флуориметры). В академической практике его использование сохраняется, но требует строгой внутренней валидации, иначе как можно доверять невоспроизводимым данным?

Хемилюминесцентный и Электрохимический анализ: Высокая чувствительность и практическое применение

Для получения наиболее полной информации об антиоксидантных свойствах, особенно в условиях, приближенных к биологическим, используются более сложные и информативные инструментальные методы — хемилюминесценция и электрохимия.

Хемилюминесценция: Дифференциация АнтиОксидантной Ёмкости и Активности

Хемилюминесцентный метод (ХЛМ) является одним из наиболее информативных для исследования АО, так как он позволяет изучать их действие в условиях, максимально имитирующих биологические свободно-радикальные реакции. Метод основан на регистрации свечения (люминесценции), возникающего в результате реакции радикалов с люминофором (например, люминолом). Антиоксидант, введенный в систему, «гасит» свечение, взаимодействуя с радикалами.

Системы генерации радикалов: Для имитации биологических систем в ХЛМ часто используются ферментативные системы, например, система, включающая пероксидазу хрена (horseradish peroxidase) и перекись водорода (H₂O₂) в присутствии люминола.

Дифференциация АОЁ и АОА. Ключевое преимущество ХЛМ заключается в возможности охарактеризовать антиоксидант не одним, а двумя независимыми показателями, что дает глубокое понимание его функциональных свойств:

1. АнтиОксидантная Ёмкость (АОЁ): Отражает общее количество радикалов, которые соединение способно нейтрализовать до того, как его собственная активность исчерпается. На кинетической кривой ХЛМ этот показатель пропорционален площади под кривой ингибирования хемилюминесценции.
2. АнтиОксидантная Активность (АОА): Отражает скорость, с которой антиоксидант взаимодействует с радикалами. Это кинетический параметр, который на кривой пропорционален углу наклона кинетической кривой на этапе ингибирования.

Такая дифференциация позволяет различить АО, которые быстро, но недолго действуют (высокая АОА, низкая АОЁ), от тех, которые действуют медленно, но длительно (низкая АОА, высокая АОЁ). Для фармацевтической разработки это означает возможность точнее прогнозировать время защитного действия препарата в организме.

Электрохимические методы (Вольтамперометрия): Экспрессность и стандартизация

Электрохимические методы (ЭХМ), прежде всего Вольтамперометрия и Амперометрия, широко применяются для определения суммарной АОА фармацевтических препаратов, фитопрепаратов и биологических жидкостей. Эти методы основаны на регистрации токов, возникающих при окислении или восстановлении антиоксиданта на поверхности рабочего электрода.

Принцип: Количественное определение АО в ЭХМ основано на их окислительно-восстановительном потенциале. Антиоксидант, являющийся восстановителем, окисляется на аноде при определенном потенциале, генерируя ток. Величина этого тока прямо пропорциональна концентрации окисляемого вещества.

Преимущества электрохимического анализа:

• Высокая чувствительность: Обнаружение АО в микромолярных концентрациях.
• Селективность: Определяются только электроактивные (окисляемые) соединения.
• Экспрессность: Анализ занимает считанные минуты и регистрируется в реальном времени.
• Универсальность: Возможность анализа мутных и сильно окрашенных образцов, что является проблемой для фотометрии.
• Экономичность: Относительно невысокая стоимость приборов и реагентов, возможность реализации в портативном исполнении.

Практическое применение и стандартизация: Применение ЭХМ, основанное на определении окислительно-восстановительного потенциала, адекватно отражает функциональное состояние субстанции и гарантирует ее эффективность, что особенно важно в фармацевтическом контроле качества. В России разработан и прошел государственные испытания вольтамперометрический анализатор «ТомьАналит ТА-Lab» (разработчик НПП «Томьаналит»). Этот прибор, использующий потенциометрические и вольтамперометрические методики, позволяет проводить высокочувствительное определение АОА в различных объектах, демонстрируя высокий уровень стандартизации и практической применимости отечественных разработок.

Количественные показатели и критерии выбора оптимального метода

Результаты, полученные различными методами, не являются взаимозаменяемыми, поскольку они оценивают разные аспекты антиоксидантного действия. Поэтому для выражения АОА используются специфические статистические показатели.

Метрологические характеристики и выражение результатов

Для обеспечения сопоставимости и научности результатов АОА используются стандартизированные метрики:

1. IC₅₀ (Half Maximal Inhibitory Concentration): Концентрация антиоксиданта, необходимая для достижения 50% ингибирования активности свободного радикала (чаще всего DPPH).
   • Выражение: IC₅₀ обычно выражается в микромолях на литр (µM) или миллиграммах на миллилитр (mg/mL).
   • Интерпретация: Чем меньше значение IC₅₀, тем выше антирадикальная активность вещества. Например, для экстрактов фукусовых водорослей Баренцева моря, антирадикальная активность, сопоставимая с кверцетином, была зафиксирована при IC₅₀ 0,035–0,038 mg/mL (против 0,026 mg/mL для кверцетина).
2. TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity): Показатель, выражающий антиоксидантную способность образца относительно Тролокса — водорастворимого аналога витамина E, используемого как эталон.
   • Выражение: TEAC является относительной единицей и выражается в микромолях Тролокс-эквивалента на грамм образца (µmol TE/g).
3. ORAC (Oxygen Radical Absorption Capacity): Отражае�� способность поглощать пероксильные радикалы (ранее выражался в единицах µmol TE/g).

Помимо этих показателей, при валидации методик обязательно оцениваются метрологические характеристики, такие как:

• Точность (Accuracy): Близость результата к истинному значению.
• Предел обнаружения (LOD): Минимальная концентрация, которую можно надежно обнаружить.
• Диапазон линейности: Интервал концентраций, в котором отклик прибора прямо пропорционален концентрации АО.

Критерии выбора метода и необходимость комплексного подхода

Выбор оптимального метода анализа антиоксидантной активности — это многофакторная задача, определяемая природой исследуемого образца и целями исследования.

Критерий выбора	Тип образца	Цель анализа	Рекомендуемый метод
Природа АО	Синтетическая субстанция (например, Эмоксипин).	Контроль качества по ОВ-потенциалу.	Электрохимические (Вольтамперометрия).
Природа АО	Сложный растительный экстракт (ЛРС).	Оценка суммарной активности.	Фотометрические (DPPH, FRAP, ABTS).
Требование к точности	Изучение кинетики и механизма действия in vitro.	Оценка АОЁ и АОА в псевдо-биологических условиях.	Хемилюминесценция.
Требование к экспрессности	Рутинный контроль на производстве.	Быстрое определение суммарного потенциала.	Электрохимические методы.

Для получения полной и неискаженной информации об антиоксидантных свойствах сложной системы (например, многокомпонентного растительного экстракта или комбинированного препарата) исследователи часто прибегают к комплексному подходу, используя 2–3 разных метода.

Обоснование комплексного подхода: Показатели АОА лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) используются для оценки их качества. Если препарат содержит полифенольные соединения (активные восстановители), метод FRAP или DPPH покажет высокую активность. Однако эти методы не дадут информации о способности АО работать в липидной фазе или ингибировать пероксильные радикалы. Только сочетание методов, основанных на разных химических принципах (например, SET — FRAP, HAT/SET — DPPH, кинетика — ХЛМ), позволяет создать функциональный профиль антиоксиданта.

Заключение

Проведенный сравнительный анализ ключевых лабораторных методов оценки антиоксидантной активности подтверждает, что в современной фармацевтической химии не существует универсального «золотого стандарта». Каждый метод оценивает лишь определенный аспект функциональной активности антиоксиданта: способность отдавать электрон (FRAP), способность нейтрализовать стабильный радикал (DPPH, ABTS) или кинетику взаимодействия с физиологически релевантными радикалами (ХЛМ).

Основной вывод заключается в неэквивалентности результатов, полученных разными методиками. Различия в механизмах генерации радикалов, реагентах, pH среды и природе регистрируемой реакции (SET vs. HAT) приводят к тому, что корреляция между, например, показателями FRAP и ORAC часто оказывается низкой.

Для объективной оценки функционального состояния антиоксиданта в фармацевтической практике наиболее перспективными являются:

1. Электрохимические методы (Вольтамперометрия): Благодаря высокой чувствительности, экспрессности и возможности прямой оценки окислительно-восстановительного потенциала, что имеет прямое отношение к биологической эффективности.
2. Хемилюминесцентный анализ (ХЛМ): Позволяет получить наиболее полную кинетическую картину, дифференцируя критически важные параметры — АнтиОксидантную Ёмкость (АОЁ) и АнтиОксидантную Активность (АОА).

Выбор метода для курсовой работы или практического анализа должен быть строго обусловлен целью исследования, типом исследуемой субстанции (синтетика или ЛРС) и требуемой степенью детализации механизма действия. Для сложных фитопрепаратов наиболее информативным является комплексный подход, сочетающий несколько методик.

Список использованной литературы

1. Оковитый С.В. Клиническая фармакология антиоксидантов. Клиническая фармакология. Избранные лекции. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. — 602 с.
2. Магин Д.В., Измайлов Д.Ю., Попов И.Н., Левин Г., Владимиров Ю.А. Фотохемилюминесценция как метод изучения антиоксидантной активности в биологических системах. Математическое моделирование // Вопросы медицинской химии. 2000. Т. 4. С. 65-68.
3. Короткова Е.И. Новый способ определения активности антиоксидантов // Журнал физической химии. 2000. Т. 74. №9. C. 1544-1546.
4. Shea T.B., Rogers E., Ashline D., Ortiz D., Sheu M.-S. Quantification of antioxidant activity in brain tissue homogenates using the ‘total equivalent antioxidant capacity’ // Journal of Neuroscience Methods. 2003. V. 125. P. 55-58.
5. Shenkin A. The key role of micronutrients // Clin. Nutr. 2006. V. 25. № 1. Р. 1-13.
6. Shacter E. Quantification and significance of protein oxidation in biological samples // Drug Metabolism Reviews. 2000. V. 32. №3-4. P. 307-326.
7. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ОБЪЕКТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И СИНТЕТИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ФАРМАЦИИ (ОБЗОР) // Электронная библиотека eLibrary.ru. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=30560120 (дата обращения: 22.10.2025).
8. ОБЗОР МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ // Электронная библиотека eLibrary.ru. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=35398246 (дата обращения: 22.10.2025).
9. Хемилюминесцентный метод определения АнтиОксидантов (АО) // Chemilum.ru. URL: http://chemilum.ru/chemilum (дата обращения: 22.10.2025).
10. ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПОДБОРУ МЕТОДИК АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ // Research Journal. 2023. № 6. URL: https://research-journal.org/archive/6/06-2023-june/issledovaniya-po-podboru-metodik-analiza-lekarstvennogo-sredstva-antioksidantnogo-dejstviya (дата обращения: 22.10.2025).
11. ОБЗОР МЕТОДОВ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА СЕРОСОДЕРЖАЩИХ АНТИОКСИДАНТОВ // Cyberleninka.ru. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/obzor-metodov-farmatsevticheskogo-analiza-serosoderzhaschih-antioksidantov (дата обращения: 22.10.2025).
12. ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ И АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ОРГАНИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ // Science Forum. 2014. URL: http://www.scienceforum.ru/2014/pdf/6606.pdf (дата обращения: 22.10.2025).
13. АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ // Традиционная медицина. 2009. № 1. URL: http://tradmed.ru/files/2009/2009-1/TM-2009-1-12.pdf (дата обращения: 22.10.2025).
14. В чем преимущества электрохимического анализа перед другими методами определения антиоксидантной… // Яндекс Q. URL: https://yandex.ru/q/question/nauka_i_obrazovanie/v_chem_preimushchestva_elektrokhimicheskogo_3a9e52c8/ (дата обращения: 22.10.2025).
15. Методология определения антиоксидантной активности пищевых продуктов и биологических жидкостей // Journal of Analytical Chemistry. URL: https://j-analytics.ru/article/2168 (дата обращения: 22.10.2025).
16. Исследование антиоксидантных свойств препаратов сочетанного действия // Уральский федеральный университет. 2021. URL: https://elar.urfu.ru/bitstream/10995/104977/1/m_f_g_2021_64.pdf (дата обращения: 22.10.2025).
17. Антиоксиданты: классификация, фармакотерапевтические свойства, использование в практической медицине // Cyberleninka.ru. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/antioksidanty-klassifikatsiya-farmakoterapevticheskie-svoystva-ispolzovanie-v-prakticheskoy-meditsine (дата обращения: 22.10.2025).
18. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ // Cyberleninka.ru. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/metody-issledovaniya-antioksidantov-1 (дата обращения: 22.10.2025).
19. антиоксидантная активность экстрактов цветов и листьев тысячелистника // Электронная библиотека БГУ. URL: https://elib.bsu.by/bitstream/123456789/189737/1/141-149.pdf (дата обращения: 22.10.2025).
20. Антиоксидантные комплексные экстракты из фукусовых водорослей Баренцева моря // Морской университет. URL: https://mauniver.ru/upload/iblock/d76/v33n3_4.pdf (дата обращения: 22.10.2025).
21. Электрохимические методы и приборы для определения антиоксидантов // Молодой ученый. 2017. № 137. С. 13-16. URL: https://moluch.ru/archive/137/38554 (дата обращения: 22.10.2025).