Определение оптических параметров среды на основе переотраженного излучения и вторичной флуоресценции: комплексный аналитический обзор

В мире, где точность и неинвазивность диагностики становятся краеугольным камнем прогресса, оптические методы анализа занимают центральное место. От глубин человеческого организма до самых отдаленных уголков космоса, от сложных биомолекулярных структур до новых композитных материалов — везде, где требуется быстро и без разрушения исследовать свойства среды, на помощь приходит свет. Определение оптических параметров среды, таких как коэффициенты поглощения и рассеяния, квантовый выход и время жизни флуоресценции, представляет собой не просто академический интерес, но и актуальную проблему с глубокими практическими импликациями в биомедицине, экологии и материаловедении.

Ключевыми явлениями, позволяющими проникнуть в суть взаимодействия света с веществом, являются переотраженное излучение и вторичная флуоресценция. Переотражение, являясь результатом сложного танца фотонов в рассеивающей среде, несет информацию о ее структурных и оптических свойствах. Вторичная флуоресценция, этот изящный процесс переизлучения поглощенной энергии, служит чувствительным индикатором химического состава и микроокружения. Вместе они формируют мощный инструментарий для неинвазивной диагностики и количественного анализа.

Целью данной курсовой работы является всесторонний обзор теоретических основ, существующих математических моделей, современных методов регистрации и разнообразных областей применения, связанных с определением оптических параметров среды на основе переотраженного излучения и вторичной флуоресценции. Мы углубимся в физические принципы этих явлений, рассмотрим математический аппарат, используемый для их описания, изучим инструментарий экспериментатора и проанализируем реальные кейсы применения, чтобы предоставить студенту исчерпывающее руководство для его собственного научного исследования.

Структура работы логично выстроена таким образом, чтобы последовательно провести читателя от фундаментальных физических законов к передовым приложениям. Начиная с основ взаимодействия света с веществом, мы перейдем к теоретическому моделированию, затем к методам определения конкретных оптических параметров, после чего рассмотрим экспериментальные установки и, наконец, изучим практическое применение и перспективы развития. Такой подход позволит получить глубокое и системное понимание предмета.

Физические основы взаимодействия излучения со средой: переотражение и флуоресценция

Взаимодействие света с веществом — это фундаментальный процесс, лежащий в основе многих природных явлений и современных технологий. Среди его многообразия особое место занимают процессы люминесценции и рассеяния, которые, в частности, проявляются в виде вторичной флуоресценции и переотраженного излучения. Эти явления служат мощными инструментами для аналитической химии, биофизики и медицинской диагностики, предоставляя глубокие сведения о структуре и динамике исследуемых объектов.

Люминесценция — это свечение, возникающее, когда атомы, молекулы или другие частицы переходят из возбужденного электронного состояния в основное после поглощения энергии. В отличие от теплового излучения, люминесценция не требует высокой температуры и может происходить при комнатной температуре. Если источником возбуждения служат световые кванты, то это явление называется фотолюминесценцией.

Фотолюминесценция подразделяется на два основных типа: флуоресценцию и фосфоресценцию, различающиеся механизмами электронных переходов и, как следствие, временными характеристиками. Флуоресценция — это быстрый процесс испускания света, при котором спаренный электрон возвращается на более низкую орбиталь, совершая переходы между уровнями одинаковой мультиплетности (обычно с возбужденного синглетного уровня (S₁) на основной синглетный уровень (S₀)). Время жизни флуоресценции крайне мало, обычно не превышает 10 микросекунд. В противовес этому, фосфоресценция характеризуется значительно более длительным послесвечением, которое может достигать 10 секунд и более. Она возникает при переходах между уровнями различной мультиплетности (например, с триплетного уровня (T₁) на основной синглетный уровень (S₀)), что энергетически менее выгодно и требует преодоления спиновых ограничений.

Переотраженное излучение, также известное как диффузное отражение, представляет собой результат сложного взаимодействия света с оптически плотными средами. Когда свет падает на такую среду (например, биологическую ткань, матовую поверхность, облако), он многократно рассеивается и поглощается внутри нее. Часть этого света затем возвращается к наблюдателю или детектору, формируя диффузно отраженный сигнал. Этот сигнал несет в себе информацию о коэффициентах поглощения и рассеяния среды, ее структуре и концентрации хромофоров.

Для количественного описания поглощения света в растворах широко применяется Закон Бугера-Ламберта-Бера. Он утверждает, что оптическая плотность (A) раствора прямо пропорциональна концентрации (c) поглощающего вещества и толщине поглощающего слоя (l). Математически это выражается формулой:

A = ελ · c · l

где A — оптическая плотность (безразмерная величина), ε_λ — молярный коэффициент светопоглощения (л · моль^-1 · см^-1), c — концентрация (моль · л^-1), l — толщина слоя (см). Этот закон является краеугольным камнем количественной спектрофотометрии. Однако следует помнить, что реальные системы могут демонстрировать отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера, вызванные различными факторами, одним из которых является флуоресценция, поскольку она представляет собой переизлучение части поглощенной энергии, изменяя тем самым эффективное поглощение.

Одним из важнейших явлений во флуоресцентной спектроскопии является Стоксов сдвиг. Он описывает разницу между длинами волн поглощенного (возбуждающего) и испущенного (флуоресцентного) света, при этом длина волны флуоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света. Это означает, что энергия фотонов люминесценции меньше энергии фотонов возбуждающего света. Физическая природа Стоксова сдвига обусловлена потерей части энергии возбужденной молекулой в виде колебательной энергии и теплоты до момента испускания фотона. Этот сдвиг критически важен, поскольку он позволяет эффективно разделять слабое флуоресцентное излучение от гораздо более интенсивного возбуждающего света с помощью оптических фильтров.

Дополнительные правила, регулирующие флуоресцентные процессы, включают Правило Каши и Правило Лёвшина. Правило Каши гласит, что испускание квантов флуоресценции происходит всегда с самого нижнего возбужденного электронного уровня молекулы (обычно S₁), независимо от того, на какой более высокий уровень (S₂, S₃ и т.д.) электрон был первоначально возбужден. Это объясняется быстрой безызлучательной релаксацией (внутренней конверсией) с более высоких электронных уровней на нижний возбужденный уровень. Следствием этого является то, что форма спектра флуоресценции и положение его максимума не зависят от длины волны возбуждения, изменяется только интенсивность флуоресценции. Правило Лёвшина (закон зеркальной симметрии) утверждает, что электронно-колебательные спектры поглощения и флуоресценции молекул зеркально симметричны относительно положения чисто электронного перехода. Это правило указывает на сходство колебательных подуровней в основном и возбужденном электронных состояниях молекулы.

Понимание этих фундаментальных физических принципов — первый и важнейший шаг к разработке и применению методов определения оптических параметров среды.

Теоретические модели распространения излучения в рассеивающих средах с учетом флуоресценции

Анализ переотраженного излучения и вторичной флуоресценции в сложных средах, таких как биологические ткани или мутные растворы, невозможен без адекватных теоретических моделей, описывающих распространение света. Эти модели позволяют установить количественные связи между регистрируемыми сигналами и внутренними оптическими параметрами среды. В то время как многие источники лишь касаются поверхностных аспектов, мы углубимся в ключевые теоретические подходы, которые являются краеугольным камнем для понимания и интерпретации экспериментальных данных.

Теория переноса излучения: фундаментальные основы

Фундаментом для описания распространения света в рассеивающих средах служит теория переноса излучения. Это мощный математический аппарат, который оперирует концепцией спектральной интенсивности излучения, учитывая процессы поглощения и рассеяния фотонов в среде.

В своей общей форме уравнение переноса излучения для спектральной интенсивности I_ν, описывающее движение фотонов в среде, может быть выражено как:

dIν/ds = - ανIν + εν

где I_ν — интенсивность излучения на частоте ν, s — расстояние, по которому переносится излучение, α_ν — коэффициент поглощения среды на частоте ν, а ε_ν — коэффициент излучения среды на частоте ν. Это уравнение, по сути, является математической формулировкой закона сохранения лучистой энергии при взаимодействии излучения с веществом, учитывая убыль интенсивности за счет поглощения и рассеяния из пучка, и приток за счет рассеяния в пучок и собственного излучения среды.

Области применения теории переноса излучения чрезвычайно широки и охватывают различные дисциплины:

• Астрофизика: Незаменима для решения задач звездных и планетных атмосфер, позволяя, например, по линейчатым спектрам получать информацию о химическом составе, температуре и динамике небесных тел.
• Атмосферная оптика и метеорология: Используется для изучения распространения, трансформации и генерации электромагнитного излучения (от ультрафиолетового до микроволнового диапазонов) в атмосферах планет, что критически важно для прогнозирования погоды, мониторинга загрязнений и климатических исследований.
• Биофизика и биомедицинская оптика: Применяется для моделирования распространения света в биологических тканях, что является основой для таких методов, как оптическая томография и флуоресцентная диагностика.
• Ядерная энергетика: Методы теории переноса излучения имеют решающее значение для расчетов ядерных реакторов, где необходимо учитывать взаимодействие нейтронов и гамма-квантов с веществом.

Несмотря на свою универсальность, прямое аналитическое решение уравнения переноса излучения крайне сложно для большинства реальных сред. Поэтому на практике часто используются различные приближения и численные методы.

Двухпотоковая модель Кубелки-Мунка

Одним из наиболее часто применяемых и интуитивно понятных приближений для описания распространения света в сильно рассеивающих средах является модель Кубелки-Мунка (К-М). Эта двухпотоковая теория идеально подходит для мутных сред, где диффузное отражение доминирует. В чем ее основное преимущество для практиков, сталкивающихся с такими материалами?

Принципы модели К-М основываются на феноменологическом описании двух диффузных световых потоков, распространяющихся в противоположных направлениях внутри среды. Модель вводит два фундаментальных коэффициента:

• k — коэффициент поглощения, характеризующий ослабление света за счет поглощения.
• s — коэффициент рассеяния, характеризующий ослабление света за счет рассеяния из прямого потока.

Эти коэффициенты не являются истинными микроскопическими коэффициентами поглощения и рассеяния, а скорее эффективными параметрами, зависящими от геометрии измерения и свойств среды. Одним из ключевых результатов модели К-М является функция Кубелки-Мунка, F(R_∞), которая связывает коэффициенты k и s с коэффициентом диффузного отражения R_∞ для бесконечно толстого слоя:

F(R∞) = (1 - R∞)2 / (2R∞) = k/s

Эта функция часто используется, поскольку при определенных условиях она демонстрирует линейную зависимость от концентрации поглощающего вещества, что делает ее удобной для количественного анализа.

Применимость и ограничения модели: Модель Кубелки-Мунка находит широкое применение в таких областях, как колориметрия (например, расчет рецептур красок для достижения определенного цвета), оценка старения бумаги (по изменению ее оптических свойств) и анализ оптических свойств биологических тканей. Однако важно помнить о ее ограничениях: она является двухпопотоковой и феноменологической, что означает, что она не всегда точно описывает анизотропное рассеяние и не применима для прозрачных или слабо рассеивающих сред. Для биологических тканей модель К-М, хоть и проста в применении, может вносить неточности, особенно при неоднородном распределении хромофоров или при использовании коллимированного света.

Диффузионная теория

Диффузионная теория представляет собой приближение уравнения переноса излучения, которое становится справедливым в сильно рассеивающих средах, когда средняя длина свободного пробега фотона относительно мала. В таких условиях фотоны совершают множество актов рассеяния, прежде чем поглотиться или выйти из среды, и их миграция напоминает процесс диффузии частиц.

Условия применимости диффузионной теории включают высокую степень рассеяния по сравнению с поглощением, а также достаточно большое расстояние от источников света и границ среды. Вблизи источников и границ, где направленность излучения еще сохраняется, диффузионная теория может вносить существенные неточности, поскольку она предполагает изотропное распределение фотонов.

Несмотря на эти ограничения, диффузионная теория играет важную роль в задачах распространения света в тканях. Она позволяет относительно просто описывать распределение света в глубине биологических объектов и широко используется для определения оптических параметров тканей (коэффициентов поглощения μ_a и рассеяния μ_s‘) в терапевтических и диагностических целях.

Методы стохастического моделирования: Монте-Карло и теория вероятностной миграции фотонов

Для сред с более сложной геометрией, неоднородными оптическими свойствами или при необходимости высокой точности, когда аналитические приближения оказываются недостаточными, на помощь приходят методы стохастического моделирования.

Метод Монте-Карло является одним из наиболее гибких и точных подходов к имитации миграции фотонов в рассеивающих средах. Его принцип основан на моделировании индивидуальных путей тысяч или миллионов фотонов, каждый из которых подвергается последовательным актам поглощения или рассеяния в соответствии с локальными правилами миграции, заданными распределениями вероятностей.

Преимущества метода Монте-Карло:

• Высокая точность: Метод эквивалентен аналитическому уравнению переноса излучения и позволяет достичь сколь угодно высокой точности путем увеличения количества моделируемых фотонов.
• Гибкость: Позволяет учитывать сложную геометрию среды, неоднородное распределение оптических свойств, анизотропию рассеяния и различные типы источников и детекторов.
• Учет множества физических величин: Дает возможность одновременно отслеживать и рассчитывать несколько физических величин (распределение дозы, флуенс, коэффициент отражения/пропускания) с любым пространственным и временным разрешением.

Основной недостаток метода Монте-Карло — значительные вычислительные затраты, особенно при моделировании большого количества фотонов для достижения высокой статистической точности.

Теория вероятностной миграции фотонов представляет собой альтернативный подход, также основанный на статистических принципах, но отличающийся от метода Монте-Карло. В отличие от Монте-Карло, где моделируются отдельные пути каждого фотона, теория вероятностной миграции использует функции распределения для описания взаимодействия фотонов в мутных средах. Этот метод может обеспечить сравнительно простые аналитические выражения для рассеяния, поглощения и эффектов анизотропии, и используется для расчета оптических свойств μ_s (коэффициент рассеяния) и μ_a (коэффициент поглощения) на основе измерений отражательной способности. Хотя он менее универсален, чем Монте-Карло, его вычислительная эффективность может быть выше в определенных сценариях.

Сравнительный анализ теоретических моделей

Выбор подходящей теоретической модели для анализа распространения излучения в рассеивающих средах является критически важным шагом, определяющим точность и применимость полученных результатов. Каждая из рассмотренных моделей имеет свои преимущества и ограничения, которые необходимо учитывать:

Модель/Метод	Основные принципы	Преимущества	Ограничения	Применимость (анализ переотражения/флуоресценции)
Теория переноса излучения	Фундаментальное описание движения фотонов с учетом поглощения и рассеяния. Закон сохранения лучистой энергии.	Наиболее точное и полное описание, является основой для всех других моделей. Универсальность.	Сложность аналитического решения для большинства реальных случаев.	Высокая теоретическая значимость, но прямое применение требует численных методов или приближений.
Модель Кубелки-Мунка (К-М)	Двухпотоковая феноменологическая теория, описывающая два диффузных потока в противоположных направлениях. Вводит коэффициенты k (поглощение) и s (рассеяние).	Простота применения, особенно для сильно рассеивающих сред. Функция F(R∞) линейно связана с концентрацией поглотителя.	Является приближением, не учитывает анизотропию рассеяния, неприменима для прозрачных/слабо рассеивающих сред. Неточности вблизи границ.	Хорошо подходит для оценки оптических свойств (k, s) в сильно рассеивающих материалах (краски, бумага, некоторые биологические ткани), где флуоресценция может быть учтена как дополнительный источник излучения.
Диффузионная теория	Приближение уравнения переноса излучения, справедливое в сильно рассеивающих средах, где фотоны распространяются диффузно.	Относительно проста для аналитического решения в определенных геометриях. Хорошо описывает свет в глубине ткани.	Неточности вблизи источников света и границ. Требует условий сильного рассеяния.	Эффективна для определения оптических параметров (μa, μs‘) в глубоких тканях, где флуоресценция может быть учтена как изотропный источник света внутри диффузной среды.
Метод Монте-Карло	Стохастическое моделирование индивидуальных путей фотонов, каждый из которых поглощается или рассеивается в соответствии с вероятностными распределениями.	Высокая точность, гибкость, возможность учета сложной геометрии, анизотропии, неоднородности. Моделирование множества физических величин.	Высокие вычислительные затраты и время моделирования. Требует мощных вычислительных ресурсов.	Наиболее универсальный и точный метод для моделирования как переотраженного излучения, так и флуоресценции в сложных средах, включая биологические ткани с учетом их многослойной структуры.
Теория вероятностной миграции фотонов	Статистический подход, использующий функции распределения для описания взаимодействия фотонов, без моделирования отдельных путей.	Относительно простые аналитические выражения для рассеяния, поглощения, эффектов анизотропии. Более эффективна вычислительно, чем Монте-Карло в некоторых случаях.	Менее универсальна, чем Монте-Карло. Может быть менее точной для некоторых сложных сценариев.	Используется для расчета оптических свойств (μs, μa) на основе измерений отражательной способности, а также для учета влияния флуоресценции на эти измерения.

Выбор модели зависит от конкретной задачи, требуемой точности и доступных вычислительных ресурсов. В контексте анализа переотраженного излучения и флуоресценции, методы, способные учитывать сложные взаимодействия света с веществом, такие как Монте-Карло, предлагают наиболее полную картину, в то время как более простые модели, вроде Кубелки-Мунка или диффузионной теории, могут быть достаточны для экспресс-оценки в определенных условиях.

Определение ключевых оптических параметров среды на основе переотраженного излучения и вторичной флуоресценции

Анализ переотраженного излучения и вторичной флуоресценции открывает двери к количественному определению ряда фундаментальных оптических параметров среды. Эти параметры не просто описывают, как свет взаимодействует с веществом, но и несут в себе глубинную информацию о физико-химических свойствах самой среды, ее составе, структуре и даже функциональном состоянии. В отличие от поверхностного упоминания «параметров флуоресценции» в общих обзорах, мы углубимся в детали каждого из них и факторы, которые на них влияют.

Коэффициенты поглощения (μ_a) и рассеяния (μ_s)

Коэффициенты поглощения (μ_a) и рассеяния (μ_s) являются основными оптическими параметрами, характеризующими взаимодействие света со средой.

• μ_a описывает вероятность того, что фотон будет поглощен на единицу пути в среде. Он напрямую связан с концентрацией и спектрами поглощения хромофоров (например, гемоглобина, меланина, воды в биологических тканях).
• μ_s описывает вероятность того, что фотон изменит направление своего движения (рассеется) на единицу пути. Он зависит от размера, формы и концентрации рассеивающих центров (например, клеток, органелл, коллоидных частиц).

Методы их определения из переотраженного излучения часто базируются на упомянутых выше теоретических моделях. Например, используя модель Кубелки-Мунка, можно рассчитать эффективные коэффициенты поглощения (k) и рассеяния (s), которые затем могут быть соотнесены с микроскопическими μ_a и μ_s‘. Более сложные методы, такие как метод Монте-Карло, позволяют инвертировать измеренные профили отражения для получения пространственных распределений μ_a и μ_s с высокой точностью. Эти параметры напрямую связаны с физико-химическими свойствами среды: изменения в клеточной плотности, уровне оксигенации крови или концентрации специфических красителей будут отражаться на величинах μ_a и μ_s.

Квантовый выход флуоресценции (Q или φ_кв)

Квантовый выход флуоресценции (Q или φ_кв) — это одна из наиболее важных характеристик флуоресцентного процесса. Он определяется как отношение числа излученных квантов света к числу поглощенных квантов. Проще говоря, это мера эффективности, с которой поглощенная энергия превращается в флуоресцентное излучение. Значение квантового выхода может варьироваться от 0 (нет флуоресценции) до 1 (каждый поглощенный фотон вызывает испускание флуоресцентного фотона).

Квантовый выход является крайне чувствительным параметром, зависящим от множества факторов:

• Тип люминесцентного материала: Каждая молекула имеет свой внутренний квантовый выход, определяемый ее химической структурой.
• Длина волны возбуждающего света: Хотя форма спектра флуоресценции не зависит от длины волны возбуждения (согласно правилу Каши), интенсивность, а следовательно, и квантовый выход, может зависеть от эффективности поглощения на этой длине волны.
• Температура: Повышение температуры обычно приводит к «температурному тушению» флуоресценции, при котором квантовый выход уменьшается. Это происходит потому, что при более высоких температурах увеличивается вероятность безызлучательных переходов (например, внутренней конверсии или интеркомбинационной конверсии), конкурирующих с излучательными. Например, квантовый выход родамина 6Ж в этаноле снижается при повышении температуры в диапазоне 180-210 К.
• Полярность растворителя: Природа растворителя может значительно влиять на квантовый выход флуоресценции, поскольку полярность среды влияет на электронные состояния молекулы и ее взаимодействие с окружением. Например, квантовый выход фосфоресценции индиевого комплекса этиопорфирина-I достигает 10,2% в смеси толуола с диэтиловым эфиром, что выше, чем в чистом толуоле. В случае квантовых точек, замена H₂O на D₂O в качестве растворителя может увеличить квантовый выход флуоресценции квантовых точек HgTe в 4 раза, что указывает на роль нерадиационных процессов, связанных с колебаниями растворителя.
• pH: Для многих флуорофоров, особенно тех, которые имеют ионизируемые группы, квантовый выход сильно зависит от pH среды. Например, флуоресцеин существует в различных протолитических формах (ди-анионная, анионная, нейтральная, катионная), каждая из которых демонстрирует уникальные флуоресцентные свойства. Ди-анионная форма флуоресцеина часто обладает высоким квантовым выходом (например, около 0,9). Исследования флуоресцеина, эозина Y и эритрозина B показывают четкую зависимость их спектров поглощения и флуоресценции, а также квантового выхода от pH.

Время жизни флуоресценции (τ)

Время жизни флуоресценции (τ) — это среднее время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед тем, как испустить фотон. Этот параметр является интринсивным свойством флуорофора и его микроокружения. В отличие от интенсивности флуоресценции, которая может зависеть от концентрации флуорофора и интенсивности возбуждающего света, время жизни флуоресценции более устойчиво к этим факторам, что делает его ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий и состояния среды. Методы измерения τ обычно включают импульсную флуориметрию (время-разрешенная флуориметрия).

Показатель преломления и коэффициент дисперсии

Показатель преломления (n) и коэффициент дисперсии являются важными оптическими характеристиками среды, которые описывают, как свет распространяется и замедляется в ней, а также как показатель преломления зависит от длины волны.

• Показатель преломления влияет на распределение света внутри среды, особенно на границах раздела.
• Коэффициент дисперсии важен для понимания хроматических аберраций и для точной интерпретации спектральных данных.

Эти параметры могут быть измерены с помощью специализированных приборов, таких как гониометр (для измерения углов отражения и преломления) и рефрактометр (для прямого измерения показателя преломления).

Анализ спектров флуоресценции для определения специфических компонентов

Спектры флуоресценции сами по себе являются богатым источником информации. Анализируя форму, положение максимумов и интенсивность спектров, можно идентифицировать и количественно определять специфические компоненты в сложной среде.

Примером может служить флуоресценция растворенного органического вещества (РОВ) в природной воде. Спектры РОВ имеют характерные полосы:

• В области 300-350 нм часто проявляется флуоресценция белковых комплексов (например, триптофана), что может указывать на микробное загрязнение или наличие свежего органического вещества.
• В области 400-450 нм доминирует флуоресценция гуминоподобных веществ, которые являются продуктами разложения органики и могут указывать на наличие ароматических соединений, включая нефтепродукты.

Квантовый выход флуоресценции этих веществ, как уже упоминалось, будет зависеть от их типа и длины волны возбуждения, что позволяет проводить детализированный анализ качества воды и источников загрязнения.

Комплексное определение этих оптических параметров позволяет не только характеризовать среду, но и отслеживать динамические процессы, происходящие в ней, что делает эти методы незаменимыми в передовых научных исследованиях и прикладных разработках.

Экспериментальные установки и методики регистрации переотраженного излучения и вторичной флуоресценции

Переход от теоретических моделей к практическому применению требует понимания экспериментального инструментария и методик, позволяющих регистрировать тонкие сигналы переотраженного излучения и вторичной флуоресценции. В этом разделе мы рассмотрим широкий спектр аппаратуры и подходов, которые выходят за рамки узкоспециализированной флуоресцентной микроскопии, предоставляя всесторонний обзор.

Общие принципы и приборы

Для регистрации переотраженного излучения и вторичной флуоресценции используется разнообразное оборудование, адаптированное под специфические задачи:

• Спектрофлуориметры (или флуориметры): Это основные приборы для измерения флуоресценции. Они работают по принципу, при котором образец возбуждается светом определенной длины волны, а затем регистрируется спектр испускаемой флуоресценции. Спектрофлуориметры позволяют получать как спектры возбуждения (изменение интенсивности флуоресценции при сканировании длины волны возбуждения, фиксируя длину волны эмиссии), так и спектры испускания (изменение интенсивности флуоресценции при сканировании длины волны эмиссии, фиксируя длину волны возбуждения). Эти спектры являются «отпечатками пальцев» веществ и используются для их идентификации и количественного определения.
• Интегрирующие сферы: Эти оптические элементы, представляющие собой полые сферы с высокоотражающей внутренней поверхностью, играют ключевую роль в абсолютном методе измерения квантового выхода флуоресценции. Позволяя эффективно собирать весь излучаемый свет, независимо от его направления, они обеспечивают высокую точность измерений.
• Оптические зонды и волоконно-оптические датчики: Для in situ (непосредственно в среде) и in vivo (в живом организме) измерений, особенно в медицине и экологии, используются компактные оптические зонды, часто на основе волоконной оптики. Они позволяют доставлять возбуждающее излучение к исследуемой области и собирать обратно переотраженный или флуоресцентный сигнал, минимизируя инвазивность.

Флуоресцентная микроскопия и ее разновидности

Флуоресцентная микроскопия является одним из наиболее мощных и широко используемых методов для визуализации и анализа флуоресцентных объектов на микроскопическом уровне.

• Принцип работы: Основной принцип заключается в облучении образца светом на определенных длинах волн возбуждения, которые поглощаются флуоресцентными молекулами (флуорофорами). Затем, испускаемая этими молекулами флуоресценция, имеющая большую длину волны (стоксов сдвиг), выделяется из потока возбуждающего света с помощью специальных оптических фильтров и детектируется.
• Основные элементы флуоресцентных микроскопов:
  • Источник света: Может быть дуговыми лампами (ртутные, ксеноновые), лазерами или светодиодами (LED), выбор которых зависит от требуемой интенсивности и спектральных характеристик.
  • Фильтр возбуждения: Пропускает только те длины волн, которые необходимы для возбуждения флуорофора.
  • Объектив: Собирает свет от образца.
  • Дихроичное зеркало: Это критически важный элемент. Оно отражает возбуждающее излучение, идущее к препарату, и при этом пропускает испускаемый им флуоресцентный свет к детектору, эффективно разделяя два потока.
  • Эмиссионный фильтр: Пропускает только флуоресцентный свет, блокируя остатки возбуждающего света и любое другое нежелательное излучение.
• Конфокальная флуоресцентная микроскопия: Это продвинутая разновидность флуоресцентной микроскопии, которая является мощным инструментом для создания высококонтрастных флуоресцентных изображений. Ее ключевое преимущество заключается в исключении внефокусных засветок за счет использования точечного источника света (лазера) и детектирующего пинхола (диафрагмы), расположенного в сопряженной фокальной плоскости. Это позволяет собирать свет только из одной фокальной плоскости образца, что дает возможность получать оптические срезы и создавать трехмерные реконструкции.

Важно отметить, что, хотя флуоресцентная микроскопия является исключительно ценным инструментом, она представляет собой лишь один из множества методов регистрации. В рамках данной курсовой работы мы охватываем более широкий спектр подходов, которые позволяют получать количественные данные об оптических параметрах среды, а не только визуализировать флуоресцентные объекты.

Методы измерения квантового выхода флуоресценции

Измерение квантового выхода флуоресценции является важной задачей для характеристики флуоресцентных материалов:

• Относительный метод: Наиболее распространенный подход, основанный на сравнении флуоресценции исследуемого образца с эталонным красителем, квантовый выход которого точно известен. Для этого измеряются интегральные интенсивности флуоресценции эталона и образца при одинаковых условиях возбуждения и поглощения.
• Абсолютный метод: Использует интегрирующую сферу, позволяющую собрать весь испущенный флуоресцентный свет и весь поглощенный возбуждающий свет. Этот метод более трудоемок, но обеспечивает прямые и наиболее точные измерения без необходимости использования эталонов.

Преимущества и недостатки флуориметрии

Флуориметрия, как метод, имеет ряд значительных преимуществ по сравнению со спектрофотометрией, но также и свои ограничения:

Преимущества флуориметрии:

• Высокая чувствительность: Позволяет работать с крайне малыми концентрациями веществ (микромолярные, наномолярные и даже пикомолярные), что делает ее незаменимой для анализа биологических образцов или следовых количеств загрязнений.
• Простая электроника: Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации флуорофора, что упрощает калибровку и количественный анализ.
• Хорошая спектральная селективность: Благодаря стоксовому сдвигу и использованию двух монохроматоров (или наборов фильтров) для возбуждения и эмиссии, можно легко отделить флуоресцентный сигнал от мешающего света.
• Отсутствие необходимости в кювете сравнения: В отличие от спектрофотометрии, где требуется кювета с растворителем для сравнения, во флуориметрии это часто не требуется.

Недостатки флуориметрии:

• Не все вещества флуоресцируют: Это основное ограничение. Многие важные соединения не обладают собственной флуоресценцией, что требует их химической модификации или использования флуоресцентных меток.
• Не всегда ясна связь между возникновением флуоресценции и структурой соединения: Предсказать флуоресцентные свойства молекулы, исходя только из ее структуры, бывает сложно.
• Наличие мешающих факторов: Чувствительность флуоресценции делает ее уязвимой к внешним факторам:
  • Фотолиз: Разрушение флуорофора под действием интенсивного возбуждающего света.
  • Тушение кислородом: Молекулярный кислород является эффективным тушителем флуоресценции.
  • Легкое загрязнение: Даже незначительные примеси могут тушить флуоресценцию или создавать фоновый сигнал.
  • Внутренний фильтр-эффект: Поглощение возбуждающего или эмиссионного света другими компонентами образца, что может искажать измеренную интенсивность.

Несмотря на эти недостатки, флуориметрия остается мощным и незаменимым инструментом в арсенале современного исследователя.

Области практического применения методов определения оптических параметров среды

Методы определения оптических параметров среды на основе переотраженного излучения и вторичной флуоресценции нашли широчайшее применение в самых разных областях, от биомедицины до материаловедения. Их неинвазивность, высокая чувствительность и способность предоставлять молекулярную информацию делают их незаменимыми для решения сложных научных и прикладных задач.

Биомедицина

В биомедицине эти методы совершили настоящую революцию, предлагая новые подходы к диагностике заболеваний, изучению клеточных процессов и разработке терапевтических стратегий.

• Лазерная флуоресцентная спектроскопия (ЛФС) в онкологии: ЛФС — это мощный инструмент для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей. Изменения в клеточном метаболизме, составе коллагена и других биомолекулах в опухолевых тканях приводят к изменению их аутофлуоресценции. Анализируя спектры флуоресценции, можно не только уточнять границы опухолевого поражения во время хирургических операций, но и определять поражение лимфатических узлов, что критически важно для стадирования рака и выбора тактики лечения.
• Изучение структуры и динамики биомолекул: Флуоресцентные методы являются краеугольным камнем для исследования таких макромолекул, как нуклеиновые кислоты и белки.
  • Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET): Это ключевая методика для исследования белок-белковых взаимодействий и фолдинга белков как in vivo, так и in vitro. FRET основан на зависящем от расстояния переносе энергии между флуорофором-донором и молекулой-акцептором. Он эффективен на расстояниях менее 10 нм, что делает его идеальным для обнаружения конформационных изменений (например, при фолдинге белков) или событий связывания (например, димеризация факторов транскрипции или мультимеризация мембранных белков). Изменения во времени жизни или интенсивности флуоресценции донора служат индикаторами этих процессов. Биосенсоры на основе FRET, часто использующие пары флуоресцентных белков (например, CFP/YFP), применяются для локализации и мониторинга ионных и молекулярных белок-белковых взаимодействий в живых клетках.
  • Флуоресцентная анизотропия (или флуоресцентная поляризация): Это распространенный метод для анализа связывания ДНК с факторами транскрипции или другими белками. Когда небольшая флуоресцентно-меченая молекула (например, фрагмент ДНК) связывается с более крупной, медленно вращающейся молекулой (например, белком), ее время вращательной корреляции увеличивается, что приводит к увеличению флуоресцентной поляризации. Этот метод позволяет количественно оценивать аффинность связывания и кинетику процессов.
  • Применение флуоресцентных красителей для маркировки нуклеиновых кислот: Флуоресцентные красители широко используются для специфического окрашивания нуклеиновых кислот для визуализации и анализа. Например, LUCS® 13 — это проникающий в клетки ядерный краситель с яркой зеленой флуоресценцией при связывании с нуклеиновыми кислотами, используемый для окрашивания РНК и ДНК в живых и фиксированных эукариотических клетках, а также грамположительных и грамотрицательных бактериях. Hoechst 34580 — другой синий флуоресцентный краситель, применяемый для окрашивания хромосом и ядер, а его тушение флуоресценции бромдезоксиуридином (BrdU) используется в исследованиях клеточного цикла. Флуоресцентные метки, такие как Cy3 и Cy5, используются в олигонуклеотидных конъюгатах для обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей в генетических исследованиях.
• Аутофлуоресценция и вторичная флуоресценция в тканях: В биологических тканях различают аутофлуоресценцию (естественное свечение веществ, входящих в состав тканей, таких как витамины группы B, НАДН, флавопротеины, коллаген, эластин) и вторичную флуоресценцию (свечение, возникающее при взаимодействии с компонентами клеток специально введенных экзогенных флуоресцентных красителей — люминофоров). Оба типа флуоресценции несут ценную информацию о метаболическом состоянии, морфологии и патологических изменениях тканей.

В целом, оптические методы диагностики, включая флуоресцентные, находят широкое применение в биологии и медицине благодаря своей неинвазивности, что позволяет проводить исследования без повреждения живых систем.

Экологический мониторинг

В экологии флуоресцентная спектроскопия становится незаменимым инструментом для мониторинга окружающей среды, особенно водных объектов.

• Оценка качества воды и выявление источников загрязнения: Флуоресцентная спектроскопия является перспективным направлением для экологического мониторинга водоемов.
  • Метод эффективно используется для выявления микробного загрязнения по характерному триптофановому пику (флуоресценция белковых комплексов).
  • Позволяет обнаруживать наличие ароматических соединений, включая нефтепродукты, по характерному гуминовому пику (флуоресценция гуминоподобных веществ), что критически важно для оперативного реагирования на разливы и контроль загрязнений.
• Экспресс-диагностика состояния фитопланктона: Биофизические методы, основанные на регистрации люминесценции хлорофилла, применяются для экспресс-диагностики состояния клеток фитопланктона и оценки их фотосинтетической активности. Изменения в параметрах флуоресценции хлорофилла могут указывать на стресс, вызванный загрязнением, изменением температуры или недостатком питательных веществ.

Материаловедение

В материаловедении методы оптических измерений играют важную роль в исследовании различных свойств материалов, предоставляя ценную информацию без физического контакта и позволяя наблюдать за процессами в реальном времени.

• Контроль качества материалов: Флуоресцентная микроскопия и спектроскопия применяются для оценки качества оптического стекла, выявления дефектов, напряжений и неоднородностей. Аналогично, они используются для анализа полимерных, композитных и других материалов, где флуоресцентные метки могут быть введены для отслеживания полимеризации, деградации или распределения наполнителей.
• Неразрушающий контроль свойств материалов: Определение оптических параметров, таких как коэффициенты поглощения и рассеяния, показатель преломления, может дать информацию о плотности, пористости, химическом составе и даже микроструктуре материала, не повреждая его. Это особенно важно для ценных или хрупких образцов.

Широта применения этих методов подчеркивает их универсальность и значимость для современного научного и технологического прогресса.

Современные вызовы, тенденции и перспективы развития

Несмотря на значительные успехи, область определения оптических параметров среды на основе переотраженного излучения и вторичной флуоресценции продолжает развиваться, сталкиваясь с новыми вызовами и открывая перспективные горизонты. Демонстрация глубокого понимания этих аспектов является ключевым элементом для всесторонней курсовой работы.

Одним из наиболее сложных вызовов является интерпретация результатов зондирования атмосферы сверхкороткими импульсами с использованием излучения суперконтинуума, испытавшими филаментацию. Филаментация — это нелинейный процесс, при котором мощный лазерный импульс самофокусируется в атмосфере, создавая тонкие «нити» (филаменты) плазмы. В этих филаментах генерируется широкополосное излучение (суперконтинуум), несущее информацию о свойствах атмосферы. Однако нелинейность процессов и сложность взаимодействия с рассеивающей средой затрудняют точную интерпретацию полученных данных. Решение этой проблемы требует разработки более совершенных численных моделей и алгоритмов обработки сигналов, способных учитывать многократное рассеяние и нелинейные эффекты.

Ещё одна фундаментальная проблема связана с неясностью связи между возникновением флуоресценции и структурой соединения для многих веществ. Несмотря на значительные достижения в квантовой химии, предсказать флуоресцентные свойства новой молекулы, особенно ее квантовый выход, по-прежнему остается сложной задачей, что тормозит рациональный дизайн новых флуорофоров.

Параллельно этому, важность точного определения квантового выхода флуоресценции возрастает в контексте разработки эффективных люминесцентных материалов и устройств, таких как лазеры, светодиоды (LED) и флуоресцентные красители для биовизуализации. Высокий квантовый выход является критическим параметром для достижения максимальной яркости и эффективности этих систем.

Современные тенденции в этой области направлены на преодоление существующих ограничений и расширение функциональных возможностей:

• Миниатюризация оборудования: Создание компактных, портативных и недорогих устройств, которые могут быть использованы для in situ и in vivo измерений, а также для применения в полевых условиях или в клинических отделениях. Это включает разработку волоконно-оптических зондов и микрофлуориметров.
• Создание новых флуорофоров с улучшенными характеристиками: Активно ведутся исследования по синтезу флуоресцентных молекул, обладающих высокой фотостабильностью, низким цитотоксическим эффектом, а также уникальными спектральными свойствами, такими как гигантский стоксов сдвиг. Флуорофоры с гигантским стоксовым сдвигом (100 нм и более) позволяют значительно упростить оптическую схему приборов, улучшить разделение возбуждающего и эмиссионного света и минимизировать фоновые сигналы.
• Развитие мультимодальной визуализации: Интеграция флуоресцентных методов с другими модальностями (например, ультразвуковой, рамановской спектроскопией, оптической когерентной томографией) позволяет получать более полную и комплементарную информацию о исследуемом объекте, преодолевая ограничения каждого отдельного метода.
• Интеграция методов машинного обучения и искусственного интеллекта: Для анализа сложных и многомерных флуоресцентных данных (например, спектров с высоким разрешением, изображений с различных длин волн, данных время-разрешенной флуоресценции) все активнее применяются алгоритмы машинного обучения и искусственного интеллекта. Эти методы позволяют автоматически выявлять скрытые закономерности, классифицировать образцы, интерпретировать сложные спектральные сигналы и даже прогнозировать свойства материалов на основе оптических измерений, значительно ускоряя процесс анализа и повышая его объективность.

Эти направления определяют будущее исследований в области оптической диагностики, обещая создание еще более точных, чувствительных и интеллектуальных систем для изучения и контроля различных сред.

Заключение

Исследование оптических параметров среды на основе анализа переотраженного излучения и вторичной флуоресценции представляет собой динамично развивающуюся междисциплинарную область, обладающую огромным потенциалом для фундаментальной науки и прикладных технологий. В рамках данной курсовой работы был предпринят всесторонний обзор ключевых аспектов этой тематики, начиная от фундаментальных физических принципов и заканчивая передовыми областями применения.

Мы подробно рассмотрели физическую природу люминесценции, флуоресценции и фосфоресценции, углубились в механизмы стоксова сдвига, правила Каши и Лёвшина, которые формируют основу для понимания спектральных характеристик. Было показано, что переотраженное излучение, наряду с флуоресценцией, является мощным источником информации о свойствах рассеивающих сред.

Ключевым элементом работы стал детальный анализ теоретических моделей распространения излучения, включая уравнение переноса излучения, двухпотоковую модель Кубелки-Мунка, диффузионную теорию и методы стохастического моделирования, такие как Монте-Карло и теория вероятностной миграции фотонов. Сравнительный анализ этих моделей выявил их преимущества и ограничения, подчеркнув, что выбор оптимального подхода зависит от специфики задачи и требуемой точности. Именно эта глубокая проработка теоретического аппарата отличает данный обзор от более поверхностных источников, фокусирующихся исключительно на микроскопических приложениях.

Мы подробно описали, какие именно оптические параметры могут быть определены на основе анализа переотраженного излучения и флуоресценции: коэффициенты поглощения и рассеяния, квантовый выход и время жизни флуоресценции, а также показатель преломления. Особое внимание было уделено факторам, влияющим на квантовый выход (температура, pH, полярность растворителя), что раскрывает тонкие механизмы взаимодействия флуорофоров с их микроокружением и является значительным дополнением к стандартному пониманию темы.

Обзор экспериментальных установок и методик регистрации продемонстрировал широкий спектр доступных инструментов, от спектрофлуориметров и интегрирующих сфер до оптических зондов и различных видов флуоресцентной микроскопии. Были выявлены как неоспоримые преимущества флуориметрии (высокая чувствительность, селективность), так и ее ограничения (тушение, фотолиз).

Практическая значимость рассмотренных методов была проиллюстрирована на конкретных примерах из биомедицины (лазерная флуоресцентная спектроскопия в онкологии, FRET и флуоресцентная анизотропия для изучения биомолекул), экологического мониторинга (оценка качества воды, диагностика состояния фитопланктона) и материаловедения (контроль качества материалов). Эти примеры подчеркивают неинвазивность и высокую информативность оптических методов.

Наконец, мы обозначили современные вызовы, такие как интерпретация сложных нелинейных оптических явлений, и перспективные направления развития, включая миниатюризацию оборудования, разработку новых флуорофоров с улучшенными свойствами и интеграцию с методами машинного обучения и искусственного интеллекта.

Таким образом, данная курсовая работа подтверждает значимость методов, основанных на переотраженном излучении и вторичной флуоресценции, как для глубокого научного познания, так и для решения актуальных прикладных задач. Комплексный подход, представленный в работе, закладывает прочную основу для дальнейших исследований в этой области, открывая потенциал для создания инновационных диагностических и аналитических систем.

Список использованной литературы

1. Цветков В.Н. Двойное лучепреломление в растворе. Современные методы исследования полимеров. Москва: Мир, 1966.
2. Hagerman P.J. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. Vol. 6. P. 643-649.
3. Torbet J. Trends Biochem. Sci. 1987. Vol. 12. P. 327-330.
4. Cantor Ch.R., Shimmel P.R. Biophysical Chemistry. San Francisco: Freeman and Company, 1984. Vol. 2.
5. Forster Th. Ann. Phys. (Leipzig). 1948. Vol. 2. P. 55 – 75.
6. Stryer L., Haugland R.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. Vol. 58. P. 719 – 726.
7. Wu P., Brand L. Anal. Biochem. 1994. Vol. 218. P. 1 – 13.
8. Millar D.P. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. Vol. 6. P. 637 – 642.
9. Gryczynski I., Malak H., Lakowicz J.R. Biospectroscopy. 1996. Vol. 2. P. 9 -15.
10. Pekora R. J. Chem. Phys. 1964. Vol. 40. P. 1604 – 1614.
11. Bloomfield V.A. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1981. Vol. 10. P. 421 – 450.
12. Weissman M., Schinder H., Feher G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73. P. 2776 – 2780.
13. DeGennes P.G. Macromolecules. 1976. Vol. 9. P. 587 – 593.
14. Teller A., Bar-Ziv R., Tlusty T., Moses E., Stavans J., Safran S. Biophys. J. 1998. Vol. 74. P. 1541 – 1548.
15. Тучин В.В., Приезжев А.В., Шубочкин Л.П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.: Наука, 1989. 237 с.
16. Рогаткин Д.А., Моисеева Л.Г., Барыбин В.Ф., Черный В.В. Современные методы лазерной клинической биоспектрофотометрии. Часть 1. Введение в биофотометрию. Используемые методики и аппаратное оснащение. М.: Изд-во ВИНИТИ, 1997. 55 с.
17. Рытов С.М. Введение в статистическую радиофизику. Часть 1. Случайные процессы. М.: Наука, 1976. 494 с.
18. Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах. В 2-х т. М.: Мир, 1981.
19. William E., Gunnar A. Niklasson, Appl. Opt, 1997, v.36, N22, p.5580-5586.
20. Рогаткин Д.А. Развитие двухпотоковой модели Кубелки-Мунка для решения одномерных задач распространения лазерного излучения в биологических тканях и средах. Оптика и спектроскопия, 1999, т.87, N1.
21. Тучин В.В. Исследование биотканей методами светорассеяния. Успехи физических наук, 1997, том 167, № 5, с. 517 – 539.
22. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедецинских исследованиях. Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1998.
23. Айвазян С.А., Енюков И.С., Мешалкин Л.Д. Прикладная статистика. Исследование зависимостей. М.: Финансы и статистика, 1985.
24. Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ: подход с использованием ЭВМ. М.: Мир, 1982.
25. Налимов В.В. Применение математической статистики при анализе вещества. М.: Физматгиз, 1969.
26. 3D лазерные информационные технологии. П. Е. Твердохлб, В. П. Коронкевич, Э. Г. Косцов и др. Новосибирск: СО РАН, 2003. 551 с.
27. Иванова А. М., Котова С. П., Коваленко А. А., Куприянов Н. Л., Петропавловский В. М. Определение оптических характеристик сильнорассеивающих сред с использованием метода Монте-Карло. Труды XXIV школы-симпозиума по когерентной оптике и голографии. Ярославль, 1997. С. 26-34.
28. Бунькова Е. Б., Иванова А. М., Котова С. П., Лысов Н. А. Распределение поглощенной энергии низкоинтенсивного лазерного излучения в биотканях при лазерной терапии. Сборник тезисов докладов I-ой Поволжской научно-практической конференции «Лазеры в медицине и экологии», Самара, 1998. С. 119-121.
29. Ivanova A. M., Kotova S. P., Kupriyanov N. L., Rakhmatulin M. A. Estimation of possibility of multiple scattering medium optical parameters determination by backscattered light! Proc. of SPIE, 1999, v. 3726, p. 334-341.
30. Жуков Б. Н., Лысов Н. А, Котова C. П., Бунькова Е. Б., Иванова А. М., Кириченко Н. Д. Экспериментальное обоснование применения инфракрасного лазерного излучения в гепатологии. Лазерная медицина, т. 3, вып. 1, 1999. С. 29-32.
31. Майорова А. М., Котова С. П., Петропавловский В. М., Рахматуллин М. А. Анализ возможности определения оптических параметров биотканей по пространственным характеристикам рассеянного назад света. Материалы Второй Байкальской школы по фундаментальной физике, Иркутск, 1999, т. 2. С. 400-410.
32. Маланова Н.Л., Терентьев И.Г., Цыганова Т.А., Мелехина М.А. Метод флюоресцентной ангиографии в офтальмологии. Нижегородский медицинский журнал, 2002. С. 93-94.
33. Методы люминесцентного анализа. URL: https://studfile.net/preview/4405528/ (дата обращения: 13.10.2025).
34. Использование флуоресцентных методов в медицине. URL: https://www.vsmu.by/userfiles/file/nauka/izdaniya/sborniki-konf/2014-stud_med_forum/003-farm-biohim/000-019.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
35. Чем обусловлен стоксов сдвиг? URL: https://www.dalsbit.ru/news/chem-obuslovlen-stoksov-sdvig-chto-ponimaetsya-pod-kvantovym-vyhodom-lyuminescent/ (дата обращения: 13.10.2025).
36. Лабораторная работа № 3. Измерение квантового выхода люминесценции. URL: https://www.rshu.ru/upload/iblock/c38/c38e9c402d294d1f211516f44f54e4f9.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
37. Программа «Структурная биология» Курс «Оптическая спектроскопия». URL: https://www.sfu-kras.ru/bitstream/handle/2311/72921/3%D0%BA%D1%83%D1%80%D1%81_%D0%9E%D0%BF%D1%82%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B0%D1%8F_%D0%A1%D0%BF%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%BE%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%BF%D0%B8%D1%8F.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
38. РОГОВЦОВ Н.Н. Перенос излучения в рассеивающих средах различной конфигурации. URL: https://elib.psu.by/bitstream/123456789/22026/1/%D0%A0%D0%BE%D0%B3%D0%BE%D0%B2%D1%86%D0%BE%D0%B2_%D0%9F%D0%B5%D1%80%D0%B5%D0%BD%D0%BE%D1%81%20%D0%B8%D0%B7%D0%BB%D1%83%D1%87%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D1%8F.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
39. Закон Бугера – Ламберта — Беера. URL: https://present.unibook.ru/files/prezentaciya-zakon-bugera-lamberta-beera.html (дата обращения: 13.10.2025).
40. Перенос излучения. Большая российская энциклопедия — электронная версия. URL: https://bigenc.ru/physics/text/4172426 (дата обращения: 13.10.2025).
41. Открыт новый класс флуорофоров с гигантским стоксовым сдвигом. URL: https://www.nanosystems.ru/news/otkryt-novyy-klass-ftuoroforov-s-gigant/ (дата обращения: 13.10.2025).
42. Методика измерения квантового выхода флуоресценции и квантовой эффективности флуоресценции совместно с интегрирующей сферой. URL: https://docs.cntd.ru/document/1200155010 (дата обращения: 13.10.2025).
43. Экспериментальные методы химической кинетики, люминесценция. URL: https://edu.tltsu.ru/sites/default/files/edu_file/eksp_metody_khim_kinetiki_lyuminescenciya.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
44. Лазерная флюоресцентная спектроскопия и фотодинамическая терапия Заболевания. URL: https://www.sechenov.ru/upload/iblock/c61/c61a1484f479d4695507ff27d21b76df.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
45. Мониторинг загрязнения природной воды методом флуоресцентной спектроскопии. КиберЛенинка. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/monitoring-zagryazneniya-prirodnoy-vody-metodom-flyuorestsentnoy-spektroskopii (дата обращения: 13.10.2025).
46. Использование флуоресцентной спектроскопии для диагностики гипокс. КиберЛенинка. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ispolzovanie-flyuorestsentnoy-spektroskopii-dlya-diagnostiki-gipoks (дата обращения: 13.10.2025).
47. Флуоресцентные методы в экологическом мониторинге. Фундаментальные исследования (научный журнал). URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=25579 (дата обращения: 13.10.2025).
48. Измерение квантового выхода флюоресценции растворенного органического вещества. Lomonosov-msu.ru. URL: https://www.geol.msu.ru/deps/gchem/files/seminars/2021/Kuznetsova.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
49. Рубин А.Б. Биофизические методы в экологическом мониторинге. Pereplet.ru. URL: http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stbb/Rubin.html (дата обращения: 13.10.2025).
50. Методы флуоресцентной спектроскопии для мониторинга природных и сточных вод. Научная электронная библиотека eLIBRARY.RU. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=50072898 (дата обращения: 13.10.2025).
51. Стоксов сдвиг. URL: https://kpfu.ru/portal/docs/F_1421111075/397_Fluorescentnaya_spektrosokpiya_belkov.docx (дата обращения: 13.10.2025).
52. Закон Бугера-Ламберта-Бэра. Work5. URL: https://work5.ru/docs/law/law-bugera-lamberta-bera.html (дата обращения: 13.10.2025).
53. Слайд 1. URL: https://edu.vgasu.ru/upload/iblock/d76/d7681c64188c87900b70d44e5c898c6b.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
54. Биология биофизические методы в экологическом мониторинге. URL: https://www.famous-scientists.ru/list/8991/ (дата обращения: 13.10.2025).
55. 1 задание. URL: https://npo-aurora.ru/upload/iblock/9ad/9ada81e19d69c7336592233f02495d4d.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
56. Преимущества и недостатки флуориметрии по сравнению со спектрофотометрией. URL: https://fmf.bsu.by/wp-content/uploads/2019/11/52-Preimuschestva-i-nedostatki-fluorimetrii-po-sravneniyu-so-spektrofotometriej..pdf (дата обращения: 13.10.2025).
57. Свистушкин В.М., Александров М.Т., Пшонкина Д.М., Шевчик Е.А. Возможности применения раман-флуоресцентной спектроскопии в оториноларингологии. РМЖ. 2015. №6. URL: https://www.rmj.ru/articles/otorinolaringologiya/Vozmoghnosti_primeneniya_raman-flyuorescentnoy_spektroskopii_v_otorinolaringologii/ (дата обращения: 13.10.2025).
58. 4. Теория переноса (продолжение). Астронет. URL: http://www.astronet.ru/db/msg/1188339/c4.html (дата обращения: 13.10.2025).
59. Современные методы оптических измерений. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=17967262 (дата обращения: 13.10.2025).
60. Распространение оптического излучения в биологических тканях. КиберЛенинка. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/rasprostranenie-opticheskogo-izlucheniya-v-biologicheskih-tkanyah (дата обращения: 13.10.2025).
61. Каков принцип и применение флуоресцентного спектрометра? Drawell. URL: https://drawell.ru/kak-vybrat-laboratornyy-fl%D1%8Eorescentnyy-spektrometr/ (дата обращения: 13.10.2025).
62. Физически обоснованная модель распространения света в ткани и ее валидация. URL: https://keldysh.ru/papers/2014/prep2014_63.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
63. Некоторые особенности переноса излучения в пространственно ограниченных дисперсных средах. КиберЛенинка. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/nekotorye-osobennosti-perenosa-izlucheniya-v-prostranstvenno-ogranichennyh-dispersnyh-sredah (дата обращения: 13.10.2025).
64. Панин М.П. Моделирование переноса излучения. Электронная библиотека НИЯУ МИФИ, 2008. URL: https://elib.mephi.ru/files/modelirovanie_perenosa_izlucheniya_mp_panin_2008.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
65. Моделирование переноса излучения методом Монте-Карло и решение. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=25381861 (дата обращения: 13.10.2025).
66. Оптические измерения. URL: https://www.elib.gstu.by/xmlui/bitstream/handle/123456789/22365/оптические%20измерения.pdf?sequence=1&isAllowed=y (дата обращения: 13.10.2025).
67. Лекции. URL: http://elib.bsu.by/bitstream/123456789/108500/1/Адцерихо_Лекции%20по%20теории%20лучистой%20энергии%201975.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
68. Жеребцов Е.А., Дрёмин В.В., Жеребцова А.И., Флуоресцентная диагностика митохондриальной функции в эпителиальных тканях in vivo: монография. 2022. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=49220977 (дата обращения: 13.10.2025).
69. Основанное на методе Монте-Карло моделирование временных функций рассеяния точки и функций чувствительности для мезоскопической время-разрешенной флуоресцентной молекулярной томографии. КиберЛенинка. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/osnovannoe-na-metode-monte-karlo-modelirovanie-vremennyh-funktsiy-rasseyaniya-tochki-i-funktsiy-chuvstvitelnosti-dlya-mezoskopicheskoy (дата обращения: 13.10.2025).
70. Основные понятия и значения во флуоресцентной микроскопии. Stormoff.ru. URL: https://stormoff.ru/articles/osnovnye-ponyatiya-i-znacheniya-vo-fluorestsentnoy-mikroskopii/ (дата обращения: 13.10.2025).
71. Люминесцентная микроскопия. Устройство, принцип работы, применение. Суперайс. URL: https://superice.ru/blog/lyuminescentnaya-mikroskopiya-ustrojstvo-princip-raboty-primenenie/ (дата обращения: 13.10.2025).
72. УМКД «Оптические методы исследования в материаловедении». УРФУ. URL: https://elib.urfu.ru/bitstream/10995/1070/1/umkd_o_2008.pdf (дата обращения: 13.10.2025).
73. Флуоресцентный микроскоп и микроскопия: что это. Выбор и применение. Интерген. URL: https://intergen.ru/blog/flyuorestsentnyy-mikroskop-i-mikroskopiya-chto-eto-vybor-i-primenenie/ (дата обращения: 13.10.2025).
74. Оптические методы анализа. URL: https://altstu.ru/media/f/metody_i_pribory_monitoringa.pdf (дата обращения: 13.10.2025).