Сахарный диабет (СД) является одним из наиболее распространенных хронических неинфекционных заболеваний, требующих пожизненной заместительной гормональной терапии. Долгое время единственным источником гормона были поджелудочные железы животных (свиней и крупного рогатого скота), однако различия в аминокислотной последовательности между животным и человеческим инсулином вызывали иммунные реакции и снижали эффективность терапии, что создавало серьезные клинические проблемы.
Переход к генно-инженерному синтезу человеческого инсулина, начавшийся в 1980-х годах, стал поворотным моментом в фармацевтической биотехнологии. Он позволил получать гормон, полностью идентичный эндогенному, в промышленных масштабах.
Ключевой тезис: Генно-инженерный инсулин человека, полученный путем экспрессии его гена в микроорганизмах, признан «золотым стандартом» заместительной терапии сахарного диабета, обеспечивая высокую степень чистоты, биобезопасности и минимальную иммуногенность. Практический результат этого технологического прорыва — повышение качества жизни миллионов пациентов по всему миру.
Целью данной работы является исчерпывающее изучение и систематизация научных принципов, технологических этапов и практического значения методов генной инженерии в производстве рекомбинантного человеческого инсулина, от проектирования молекулы до финального контроля качества.
Молекулярно-биологические предпосылки рекомбинантного синтеза
Эффективность генно-инженерного процесса напрямую зависит от глубокого понимания молекулярной структуры и биосинтеза целевого белка. Архитектура инсулина, состоящая из двух цепей и трех дисульфидных мостиков, диктует все последующие шаги клонирования и очистки. Критически важно, что правильное формирование активной молекулы возможно только при тщательном контроле на всех стадиях.
Структура и функция гормона
Инсулин представляет собой пептидный гормон, который в зрелой форме состоит из двух полипептидных цепей: А-цепь, включающая 21 аминокислотный остаток, и В-цепь, состоящая из 30 аминокислотных остатков. Эти цепи соединены между собой двумя межцепочечными дисульфидными связями (A7-B7 и A20-B19). Кроме того, стабильность пространственной структуры белка обеспечивается третьей, внутримолекулярной дисульфидной связью, расположенной в А-цепи (A6-A11).
Критическое значение имеет правильный фолдинг (сворачивание) молекулы, который гарантирует корректное образование всех трех дисульфидных мостиков. Нарушение конформации делает гормон неактивным и может повысить его иммуногенность. На финальной стадии производства, в готовых лекарственных формах, активная молекула инсулина обычно находится в виде гексамера, стабилизированного двумя ионами цинка (Zn2+), что также должно быть воспроизведено.
Роль проинсулина в синтезе
В физиологических условиях (в β-клетках поджелудочной железы) инсулин не синтезируется сразу в активной двухцепочечной форме. Сначала образуется длинный одноцепочечный предшественник — проинсулин.
Проинсулин включает в себя последовательности А-цепи, В-цепи и соединяющий их С-пептид (31–35 аминокислотных остатков). С-пептид играет ключевую роль в нативном синтезе, выступая в качестве внутреннего шаперона, который направляет и стабилизирует правильный фолдинг молекулы и образование дисульфидных связей *in vivo*.
Ключевой аспект рекомбинантного синтеза: Поскольку прокариотические системы (например, E. coli) не способны обеспечить сложный эукариотический фолдинг и процессинг, генно-инженерное производство, как правило, ориентируется на синтез одноцепочечного предшественника (проинсулина) или его аналогов. Это позволяет использовать механизм, который имитирует естественный процесс созревания гормона, требуя последующего удаления С-пептида *in vitro* после завершения ренатурации и формирования конформации.
Стратегии генно-инженерного конструирования и выбор системы экспрессии
Выбор стратегии клонирования и системы экспрессии определяет выход продукта, его качество и сложность последующих стадий очистки. Именно на этом этапе закладываются экономическая эффективность и технологические риски всего производства.
Создание рекомбинантной плазмиды
Первым этапом является конструирование рекомбинантной ДНК. Ген, кодирующий проинсулин, синтезируется химически или выделяется из кДНК и встраивается в подходящий вектор.
В производстве рекомбинантного человеческого инсулина в качестве векторов чаще всего используются модифицированные производные плазмиды Escherichia coli pBR322, например, pPINS07 или pHINS11.
Для обеспечения стабильной и высокоэффективной экспрессии в клетке-хозяине ген проинсулина обычно экспрессируется не самостоятельно, а в составе гибридного (химерного) белка. Целевой белок сливается с так называемой лидерной последовательностью или фрагментом другого, хорошо экспрессируемого белка.
Такой подход решает две основные задачи в бактериальной системе E. coli:
- Стабилизация продукта: Слитый белок более устойчив к протеолитическому расщеплению внутри бактериальной клетки.
- Формирование телец включения: Экспрессия гибридного белка происходит на очень высоком уровне, что приводит к его агрегации в нерастворимые тельца включения (inclusion bodies). Это облегчает первичную очистку, так как тельца включения легко отделяются от растворимых белков клетки.
В качестве стабилизирующего фрагмента (тега слияния) могут использоваться синтетические домены стафилококкового белка А (IgG-связывающие домены) или гексагистидиновый домен. Патентованные штаммы-продуценты, используемые в РФ, часто представляют собой E. coli JM109/pPINS07 или E. coli BL21/pPINS07(BL07).
Сравнительный анализ промышленных штаммов-продуцентов (E. coli vs. Дрожжи)
Промышленный синтез рекомбинантных белков сегодня базируется на двух основных системах: бактериальной (E. coli) и дрожжевой (Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris).
Подход на основе Escherichia coli
| Характеристика | Преимущества | Недостатки |
|---|---|---|
| Система | Прокариотическая, E. coli | Внутриклеточная экспрессия (тельца включения) |
| Экономичность | Низкая стоимость питательных сред, быстрый рост. | Требует сложных стадий солюбилизации и ренатурации *in vitro*. |
| Выход | Высокая плотность биомассы и высокий выход целевого белка (до 3 г/л). | Отсутствие механизмов посттрансляционной модификации и секреции. |
| Продукт | Гибридный белок-предшественник. | Риск неправильного фолдинга, требующий тщательного контроля. |
Метод E. coli является наиболее распространенным благодаря его экономической эффективности и возможности достижения высокой концентрации продукта. Однако он требует обязательного механического разрушения клеток (дезинтеграции), выделения нерастворимых телец включения и последующей трудоемкой химико-ферментативной обработки.
Подход на основе Дрожжей (Pichia pastoris)
Метилотрофные дрожжи, такие как Komagataella phaffii (ранее Pichia pastoris), являются популярной эукариотической системой.
| Характеристика | Преимущества | Недостатки |
|---|---|---|
| Система | Эукариотическая, Pichia pastoris | Секреция во внешнюю среду. |
| Фолдинг | Способность к секреции белка и обеспечению правильной конформации (*in vivo* фолдинг) и образованию дисульфидных связей. | Культивирование может быть сложнее, чем у E. coli. |
| Экспрессия | Используется сильный индуцируемый промотор PAOX1, активируемый метанолом. | Риск нежелательного или избыточного гликозилирования белка. |
| Продукт | Секретируемый одноцепочечный предшественник проинсулина. | Требуется дополнительная очистка для удаления гликозилированных форм. |
Проблема гликозилирования: В случае производства стандартного инсулина человека это не критично, но при синтезе аналогов инсулина (например, инсулина Гларгина), дрожжевые системы могут производить моно-, три- или полигликозилированные формы белка. Эти модификации, которые не должны присутствовать в фармацевтически приемлемом продукте, требуют особо тщательной очистки, что увеличивает сложность *downstream processing*. Несмотря на это, эукариотическая система часто предпочтительнее для получения сложных белков и аналогов, так как она может обеспечить более нативную конформацию. Но разве не является ли это оправданием для выбора более дорогих и сложных в культивировании систем?
Технологический процесс выделения, очистки и конверсии (Downstream Processing)
После завершения ферментации и накопления целевого продукта начинается самая сложная и дорогостоящая часть процесса — выделение, очистка и модификация рекомбинантного белка (Downstream Processing, DSP). Именно этот этап требует до 80% всех производственных затрат.
Выделение и ренатурация гибридного белка
Технология DSP для E. coli начинается с обработки биомассы.
- Дезинтеграция клеток: Клетки-продуценты концентрируются (сепарирование) и разрушаются механически (например, гомогенизацией под высоким давлением), ультразвуком или химически.
- Выделение телец включения: Нерастворимые тельца включения, содержащие гибридный белок, отделяются от клеточного дебриса и растворимых белков путем многократного центрифугирования и отмывки.
- Солюбилизация: Для высвобождения целевого белка тельца включения растворяют в сильных денатурирующих агентах, чаще всего в 8 М мочевине или 6 М гуанидинхлориде, в присутствии восстановителей (например, дитиотреитола), которые разрывают все существующие дисульфидные связи.
- Ренатурация (Рефолдинг): Солюбилизированный белок помещают в сильно разбавленный буфер в окислительных условиях. Цель этого этапа — позволить полипептидной цепи принять правильную пространственную конформацию и сформировать три корректные дисульфидные связи. Этот процесс является критически важным и оптимизируется по концентрации белка, pH и температуре.
Ферментативная конверсия и первичная очистка
На этом этапе гибридный белок или проинсулин превращается в активный двухцепочечный инсулин.
Протеолитическое расщепление
Для удаления С-пептида (и/или тега слияния) используются специфические протеолитические ферменты. Ключевыми ферментами в конверсии проинсулина в активный инсулин являются:
- Трипсин: Расщепляет пептидные связи по карбоксильной стороне лизина и аргинина. Используется для удаления С-пептида.
- Карбоксипептидаза Б: Используется для удаления С-концевых остатков лизина и/или аргинина, которые могут оставаться после действия трипсина, обеспечивая точное отщепление и формирование конечной молекулы инсулина.
Конверсия может проводиться последовательно или совместно. Например, для получения активного инсулина из проинсулина, полученного в дрожжах, применяется совместное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б.
Первичная очистка
После конверсии используется осаждение примесей подкислением, а также ионообменная хроматография (например, на КМ-Сефарозе или СП-Сефарозе), которая разделяет белки на основе их заряда при заданном pH.
Финальная высокоэффективная очистка
Для получения субстанции фармацевтического качества требуются методы с высокой разрешающей способностью.
Обращенно-Фазовая Высокоэффективная Жидкостная Хроматография (ОФ ВЭЖХ): Это ключевой метод финальной очистки, который разделяет молекулы на основе их гидрофобности. ОФ ВЭЖХ позволяет отделить целевой инсулин от его близких структурных примесей, таких как не до конца расщепленный проинсулин, дезамидоинсулин и другие пептидные фрагменты.
Требования Государственной Фармакопеи РФ к чистоте субстанции инсулина растворимого [человеческого генно-инженерного] устанавливают, что содержание целевого вещества (инсулина и A21-дезамидоинсулина) должно составлять не менее 95,0% в пересчете на сухое вещество.
Гель-фильтрация (Молекулярные сита): Используется на заключительном этапе для удаления высокомолекулярных примесей (агрегатов инсулина, остатков белков-предшественников) и контроля молекулярной массы.
Контроль качества и регуляторные требования к генно-инженерному инсулину
Производство биофармацевтических препаратов, включая рекомбинантный инсулин, регулируется строжайшими правилами Надлежащей производственной практики (GMP) и соответствующими фармакопейными статьями.
Стандарты чистоты и примесей (ГФ РФ)
Обеспечение чистоты является критическим фактором, поскольку даже малые примеси могут вызвать иммунный ответ у пациента. Требования российских фармакопейных статей (ОФС и ГФ) к генно-инженерному инсулину человека являются одними из самых строгих в мире. Это подтверждает международный статус российского биофармацевтического контроля.
Критические показатели чистоты (согласно ГФ РФ):
- Содержание A21-дезамидоинсулина: Эта примесь образуется в результате дезаминирования аспарагина в позиции A21 и является наиболее частой деградационной формой. Согласно ОФС, содержание A21-дезамидоинсулина должно быть не более 2%.
- Сумма других примесей: Сумма всех прочих примесей (кроме A21-дезамидоинсулина) не должна превышать 2%.
- Высокомолекулярные примеси: Примеси с молекулярной массой, превышающей молекулярную массу инсулина (агрегаты и димеры), строго контролируются методом эксклюзионной хроматографии.
Эти жесткие ограничения требуют постоянного мониторинга процесса очистки и применения высокочувствительных аналитических методов.
Современные методы аналитического контроля
Для контроля качества на промежуточных стадиях очистки и для финального анализа используются передовые тандемные методы.
Высокоэффективная Жидкостная Хроматография–Масс-Спектрометрия (ВЭЖХ-МС): Эта комбинация является золотым стандартом в анализе рекомбинантных белков. Хроматография обеспечивает физическое разделение компонентов, а масс-спектрометр позволяет точно идентифицировать и количественно оценить целевой продукт, его изоформы и самые малые пептидные примеси по их молекулярной массе. Применение ВЭЖХ-МС позволяет гарантировать, что в субстанции не присутствуют остатки клеточных белков-хозяев или нежелательных модификаций, таких как избыточное гликозилирование.
Биобезопасность и оценка биоподобия
Воспроизводимость и безопасность производства гарантируются строгим управлением банков клеток-продуцентов (Главный банк клеток, ГБК, и Рабочий банк клеток, РБК).
Для новых генно-инженерных препаратов, претендующих на звание биоподобных (bio-similar) оригинальному инсулину, необходима не только доказательство высокого качества субстанции, но и подтверждение их терапевтической эквивалентности.
Оценка биоподобия (ФК/ФД профили): Ключевым инструментом для сравнения фармакокинетического (ФК) и фармакодинамического (ФД) профилей биоподобных инсулинов является эугликемическое гиперинсулинемическое клэмп-исследование (euglycaemic hyperinsulinaemic clamp).
Методология: В ходе этого исследования концентрация глюкозы в крови испытуемого поддерживается на постоянном (эугликемическом) уровне путем введения глюкозы, а инсулин вводится в постоянном количестве (гиперинсулинемия). Скорость инфузии глюкозы (GIR), необходимая для поддержания стабильного уровня, служит прямым показателем фармакодинамической активности (поглощения глюкозы тканями) исследуемого инсулина. Это исследование проводится в рамках I фазы клинических испытаний и является обязательным для подтверждения, что новый биоподобный инсулин эквивалентен препарату сравнения по безопасности и клинической эффективности.
Заключение
Методы генной инженерии позволили осуществить революцию в терапии сахарного диабета, заменив животный инсулин на рекомбинантный человеческий гормон. Технологический процесс его получения представляет собой сложную, многостадийную схему, которая интегрирует достижения молекулярной биологии, микробной ферментации и аналитической химии.
Ключевые принципы производства рекомбинантного инсулина, которые обеспечивают его фармацевтическую при��млемость:
- Синтез через предшественник: Необходимость синтеза в виде проинсулина (или гибридного белка) для обеспечения правильного фолдинга и стабилизации в прокариотической системе (E. coli).
- Сложность DSP: Высокая эффективность бактериальных систем (E. coli — до 3 г/л) сопряжена со сложностью *in vitro* солюбилизации, ренатурации и формирования трех критически важных дисульфидных связей.
- Ферментативная конверсия: Применение протеолитических ферментов (Трипсин и Карбоксипептидаза Б) для точного удаления С-пептида.
- Сверхвысокие требования к чистоте: Использование препаративной ОФ ВЭЖХ и строгое соблюдение фармакопейных стандартов (ГФ РФ), которые ограничивают примеси (например, A21-дезамидоинсулин) на уровне не более 2%.
В настоящее время генная инженерия является доминирующим методом получения инсулина и его аналогов. Перспективы развития связаны с дальнейшей оптимизацией систем экспрессии (особенно дрожжевых, для получения аналогов с улучшенными ФК/ФД характеристиками) и разработкой новых аналитических платформ (ВЭЖХ-МС) для повышения биобезопасности и стандартизации качества.
Список использованной литературы
- Балаболкин, М. И. Сахарный диабет: современные аспекты диагностики и лечения / М. И. Балаболкин, Е. М. Клебанова, В. М. Креминская. — М.: РЛС-2005, 2004. — 960 с.
- Гавриков, А. В. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека: дис. … канд. биол. наук. — М., 2003.
- Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности / А. Б. Романчиков [и др.] // Биоограническая Химия. — 1997. — Т. 23, № 2.
- Глик, Б. Молекулярная биотехнология / Б. Глик, Дж. Пастернак. — М.: Мир, 2002. — 589 с.
- Девис, Р. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий / Р. Девис, Д. Ботстайн, Дж. Рот; пер. с англ. — М.: Мир, 1984. — 176 с.
- Ермишин, А. П. Генетически модифицированные организмы: мифы и реальность / А. П. Ермишин. — Мн.: Тэхналогйя, 2004. — 118 с.
- Основы фармацевтической биотехнологии: учебное пособие / Т. П. Прищеп [и др.]. — Ростов-на-Дону: Феникс; Томск: НТЛ, 2006.
- Патрушев, Л. И. Искусственные генетические системы. — М.: Наука, 2004.
- Рыбчин, В. Н. Основы генетической инженерии: учебник для вузов / В. Н. Рыбчин. — 2-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СПбГТУ, 2002. — 522 с.
- Щелкунов, С. Н. Генетическая инженерия. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2008.
- [Биотехнологии] [Электронный ресурс]. — URL: http://www.biotechnolog.ru/ge/ge3_1.htm (дата обращения: 31.10.2025).
- [Микробиология] [Электронный ресурс]. — URL: http://microbiologu.ru (дата обращения: 31.10.2025).