Методы количественного определения лекарственных средств и их метаболитов в биологических жидкостях: всесторонний академический обзор

В мире фармации, где каждая нанограмма может иметь решающее значение для здоровья пациента, точность количественного определения лекарственных средств и их метаболитов в биологических жидкостях является не просто научной задачей, а фундаментальным столпом клинической практики и разработки новых препаратов. Ежегодно миллионы пациентов по всему миру принимают лекарства, и понимание того, как эти вещества распределяются, метаболизируются и выводятся из организма, лежит в основе их безопасного и эффективного применения. Это область, где наука встречается с реальной жизнью, где сложная аналитическая химия напрямую влияет на результат лечения.

Этот академический обзор предназначен для того, чтобы предложить комплексное и глубокое погружение в мир биоанализа лекарственных средств. Мы рассмотрим не только передовые высокотехнологичные подходы, но и фундаментальные оптические и хроматографические методы, которые продолжают играть важную роль. Наша цель — представить каждый метод в контексте его теоретических основ, практических аспектов, преимуществ и ограничений, а также осветить критически важные регуляторные требования, обеспечивающие надежность получаемых данных.

Введение: Фундаментальные принципы и клиническое значение биоанализа лекарственных средств

Биоаналитическая методика — это не просто лабораторный процесс, а ключевой инструмент для расшифровки сложного взаимодействия между лекарственным веществом и живым организмом, представляющий собой метод количественного определения лекарственных веществ (ЛВ) и/или их метаболитов в различных биологических объектах человека и животных, таких как цельная кровь, плазма, сыворотка, моча и другие. Актуальность и значимость такого рода исследований невозможно переоценить, поскольку они формируют основу для фармакокинетических, токсикокинетических исследований и терапевтического лекарственного мониторинга (ТЛМ), позволяя принимать обоснованные решения в области разработки лекарств и персонализированной медицины, что в конечном итоге повышает эффективность лечения и безопасность пациентов.

Фармакокинетика и метаболизм ЛС

Фармакокинетика – это динамическая наука, которая изучает «судьбу» лекарственного средства в организме от момента его введения до полного выведения. Она охватывает четыре ключевых процесса, часто обозначаемых акронимом ADME: всасывание (Absorption), распределение (Distribution) в различных органах и тканях, связывание с белками, метаболизм (Metabolism) и выведение (Excretion). Понимание этих процессов критически важно для определения оптимальной дозировки, режима приема и оценки потенциальных взаимодействий с другими препаратами.

Особое внимание в фармакокинетике уделяется метаболизму – процессу, в ходе которого исходное лекарственное средство преобразуется в метаболиты, часто обладающие измененной фармакологической активностью или токсичностью. Анализ метаболитов имеет решающее значение в доклинических и клинических исследованиях. Например, токсичные метаболиты могут вызывать серьезные побочные эффекты, которые невозможно предсказать, анализируя только исходное соединение. Известны случаи, когда именно метаболиты были причиной нежелательных реакций. Недооценка этого аспекта может привести к серьезным угрозам для здоровья пациента и отзыву препарата с рынка.

Примеры токсичных метаболитов и их побочных эффектов:

• Парацетамол (ацетаминофен): При передозировке метаболит N-ацетил-п-бензохинонимин (NAPQI) вызывает острое повреждение печени, что может привести к печеночной недостаточности и даже смерти.
• Аспирин: В высоких дозах метаболиты могут усиливать окислительный стресс и вызывать нейротоксичность центральной нервной системы, проявляющуюся в виде тиннитуса, головокружения и спутанности сознания.
• Абакавир: Ингибирование глутатионредуктазы метаболитами этого антиретровирусного препарата может приводить к серьезным неблагоприятным реакциям гиперчувствительности.
• Многие препараты и их метаболиты оказывают прямое токсическое действие на печень и почки, провоцируя хронический гепатит, холестаз или интерстициальный нефрит.

Тщательный анализ метаболитов позволяет своевременно выявлять потенциально опасные соединения, корректировать структуру новых лекарств на стадии разработки и обеспечивать максимальную безопасность для пациентов.

Терапевтический лекарственный мониторинг (ТЛМ)

В клинической практике точность не менее важна. Терапевтический лекарственный мониторинг (ТЛМ) – это мощный инструмент, основанный на определении концентрации лекарственного вещества и его метаболитов в плазме крови или других биологических жидкостях. Его основная цель – индивидуализировать лекарственную терапию таким образом, чтобы концентрация вещества находилась в оптимальном «терапевтическом окне», то есть не превышала минимальную токсическую и не опускалась ниже минимальную терапевтическую.

ТЛМ имеет критическое значение для препаратов с узким терапевтическим окном – это лекарства, для которых разница между эффективной и токсичной дозой очень мала. В таких случаях малейшее отклонение от оптимальной концентрации может привести либо к отсутствию терапевтического эффекта, либо к развитию серьезных побочных реакций. Что же это значит для врача? Это означает, что без ТЛМ риск неэффективности или токсичности терапии значительно возрастает, особенно у пациентов с измененным метаболизмом или сопутствующими заболеваниями.

Примеры лекарственных средств с узким терапевтическим окном, для которых ТЛМ имеет решающее значение:

• Литий: Применяется при биполярных расстройствах. Высокие концентрации могут вызывать тремор, атаксию, судороги и даже кому.
• Дигоксин: Сердечный гликозид, используемый при сердечной недостаточности. Токсические уровни проявляются аритмиями и нарушениями зрения.
• Варфарин: Антикоагулянт. Неправильная дозировка может привести к кровотечениям или, наоборот, к тромбозам.
• Некоторые антибиотики: Аминогликозиды (например, гентамицин) могут вызывать ото- и нефротоксичность.
• Антиаритмики: Например, амиодарон, хинидин. Неправильная концентрация может привести к проаритмогенным эффектам.
• Иммунодепрессанты: Такролимус, сиролимус, циклоспорин, эверолимус. Жизненно важны для предотвращения отторжения органов после трансплантации, но имеют высокую токсичность.
• Антиконвульсанты: Фенитоин, карбамазепин. Используются для контроля эпилепсии, но могут вызывать седацию и другие неврологические нарушения.
• Антиретровирусные препараты: Требуют точного дозирования для поддержания вирусной супрессии и предотвращения резистентности.

Целевой уровень препарата при ТЛМ зависит от самого препарата, целей терапии и времени проведения анализа. Для многих препаратов важен «минимальный» уровень (концентрация перед приемом следующей дозы), тогда как для других, например, эноксапарина и некоторых антибиотиков, контроль проводится через 4–6 часов после приема, чтобы оценить пиковую концентрацию. Мониторинг метаболитов также критически важен для корректировки доз в персонализированной медицине, помогая поддерживать уровни препарата в безопасном и эффективном диапазоне. Таким образом, биоанализ является мостом между фундаментальной наукой и персонализированной медициной, обеспечивая безопасность и эффективность лекарственной терапии.

Методы пробоподготовки биологических образцов: ключевой этап биоанализа

Прежде чем приступить к количественному определению лекарственных средств и их метаболитов, необходимо решить одну из самых сложных задач биоанализа – подготовку биологического образца. Биологическая матрица, будь то кровь, моча или ткани, представляет собой сложнейшую смесь тысяч различных соединений: белков, липидов, солей, углеводов и других эндогенных веществ. Эти компоненты не только могут мешать анализу, но и значительно снижать чувствительность и точность определения целевых аналитов, поэтому пробоподготовка является критически важным этапом, который обеспечивает чистоту образца, концентрирование аналита и совместимость с выбранным аналитическим методом. Выбор метода пробоподготовки определяется множеством факторов, включая природу исследуемого вещества, его химические свойства, целевой диапазон концентраций, состав матрицы и, конечно, выбранный метод анализа.

Осаждение белков

Одним из самых простых и широко используемых методов пробоподготовки является осаждение белков. Белки являются основными компонентами биологических жидкостей, которые могут связываться с лекарственными веществами, блокировать колонки хроматографов и создавать помехи в оптических методах. Принцип осаждения белков основан на денатурации – разрушении их пространственной структуры, что приводит к потере растворимости и выпадению в осадок.

Это достигается различными способами:

• Использование органических растворителей: Ацетонитрил, метанол, этанол добавляются к образцу, вызывая дегидратацию и денатурацию белков.
• Добавление кислот: Трихлоруксусная кислота (ТХУ), перхлоратная кислота эффективно денатурируют белки.
• Соли тяжелых металлов: Ионы тяжелых металлов (например, свинца, цинка, меди) связываются с функциональными группами боковых радикалов аминокислот в молекуле белка, нарушая его третичную и четвертичную структуру, что приводит к осаждению. Однако, при добавлении избытка солей тяжелых металлов (кроме серебра (I) нитрата (AgNO₃) и ртути (II) хлорида (HgCl₂)) возможно повторное растворение осадка. Это происходит из-за абсорбции избыточных ионов металла и приобретения белковой молекулой положительного заряда, что может привести к образованию растворимых комплексов. После осаждения белки отделяются центрифугированием, а надосадочная жидкость, содержащая аналиты, используется для дальнейшего анализа.

Жидкостно-жидкостная экстракция (ЖЭ)

Жидкостно-жидкостная экстракция (ЖЭ) является классическим методом, основанным на различии в растворимости аналита в двух несмешивающихся фазах: водной (биологическая жидкость) и органической (экстрагент). Этот метод предполагает извлечение лекарственных препаратов из биологических жидкостей (крови, мочи, желчи) с использованием органических растворителей, таких как хлороформ с ацетоном или ацетонитрилом, диэтиловый эфир, этилацетат.

Принцип действия:

1. Смешивание: Биологический образец смешивается с органическим растворителем.
2. Распределение: Целевое лекарственное вещество, обладающее большей растворимостью в органической фазе, переходит из водной фазы в органическую.
3. Разделение: Фазы разделяются, и органическая фаза, содержащая аналит, может быть сконцентрирована (например, выпариванием) для повышения чувствительности.

ЖЭ позволяет эффективно очищать образец от многих гидрофильных примесей, но требует значительных объемов растворителей, что может быть неэкологично и трудозатратно.

Твердофазная экстракция (ТФЭ) и микроэкстракция (ТФМЭ)

Твердофазная экстракция (ТФЭ) — это более современный и эффективный способ подготовки проб, позволяющий выделить и сконцентрировать аналиты из сложной матрицы, одновременно очищая их от мешающих компонентов. Метод завоевал широкое признание благодаря своей высокой эффективности, скорости и возможности автоматизации.

Принцип ТФЭ заключается в избирательном удерживании целевых соединений (аналитов) на поверхности сорбента и их последующем элюировании (высвобождении) подходящими растворителями. Сорбенты для ТФЭ представляют собой частицы с развитой поверхностью, упакованные в небольшие картриджи или планшеты.

Основные этапы ТФЭ:

1. Кондиционирование (активация) сорбента: Перед загрузкой образца сорбент промывается растворителем для удаления примесей и активации его поверхности.
2. Загрузка образца (адсорбция аналитов): Биологический образец пропускается через сорбент, при этом целевые аналиты адсорбируются на поверхности сорбента, а большинство мешающих веществ проходят сквозь него.
3. Промывка: После загрузки образца сорбент промывается слабым растворителем для удаления оставшихся мешающих веществ, не удерживая при этом аналиты.
4. Элюирование (высвобождение аналитов): Аналиты вымываются с сорбента сильным растворителем, который избирательно нарушает их взаимодействие с сорбентом.

Механизмы взаимодействия между аналитом и сорбентом:

• Неполярный (обращенно-фазовые сорбенты): Используется для выделения неполярных и умеренно полярных соединений из водных растворов. Сорбент имеет неполярную поверхность (например, модифицированный силикагель с С18), а элюирование происходит полярными растворителями.
• Полярный (нормально-фазовые сорбенты): Используется для полярных соединений из неполярных растворителей. Сорбент имеет полярную поверхность (например, немодифицированный силикагель), элюирование — более полярными растворителями.
• Ионообменный: Используется для заряженных соединений. Сорбент имеет ионообменные группы (катионо- или анионообменные), элюирование – растворами с измененным pH или высокой ионной силой.
• Комбинированный: Некоторые сорбенты сочетают несколько механизмов (например, гидрофобное и ионообменное взаимодействие) для более эффективного выделения.

Твердофазная микроэкстракция (ТФМЭ) является более усовершенствованной версией ТФЭ. Она использует тонкое волокно, покрытое сорбентом, которое погружается непосредственно в биологический образец или в его паровую фазу. Это позволяет выделять и концентрировать аналиты без использования растворителей для загрузки образца. ТФМЭ активно используется в клиническом анализе крови, мочи, мышц и других биологических жидкостей и тканей, позволяя выделять десятки различных соединений для последующего анализа ЖХ или ГХ с масс-спектрометрическим детектированием.

Мембранная ТФЭ представляет собой еще одну инновационную модификацию, основанную на использовании пористой мембраны с упакованным внутри сорбентом. Эта технология позволяет одновременно проводить выделение, концентрирование и очистку аналитов, значительно упрощая и ускоряя процесс пробоподготовки.

Выбор оптимального метода пробоподготовки – это искусство, требующее понимания физико-химических свойств аналита и особенностей биологической матрицы, но именно этот этап зачастую определяет успех всего биоаналитического исследования.

Оптические методы количественного определения: основы, применение и ограничения

В арсенале аналитической химии оптические методы занимают особое место, предлагая быстрые, относительно недорогие и достаточно чувствительные подходы к количественному определению. Спектрофотометрия и флуориметрия, хотя и являются одними из старейших методов, продолжают активно использоваться в биоанализе благодаря своей универсальности и простоте. Сравнение их чувствительности и специфичности позволяет понять, почему эти методы, несмотря на появление более сложных технологий, остаются востребованными.

Спектрофотометрия в УФ и видимой областях

Спектрофотометрия в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях спектра – это краеугольный камень аналитической химии, применяемый для количественного и качественного анализа лекарственных средств в жидком, твёрдом или газообразном состоянии.

Принцип метода основан на явлении поглощения света молекулами вещества. Когда свет определенной длины волны проходит через раствор, молекулы аналита поглощают часть энергии, что приводит к уменьшению интенсивности прошедшего света. Интенсивность поглощения прямо пропорциональна концентрации вещества и толщине слоя раствора, через который проходит свет. Это фундаментальное соотношение описывается Законом Бугера-Ламберта-Бера:


A = εcl


Где:

• A — оптическая плотность (абсорбция) раствора, безразмерная величина.
• ε — молярный коэффициент поглощения, характерный для каждого вещества при определенной длине волны (л·моль^-1·см^-1).
• c — молярная концентрация вещества (моль/л).
• l — толщина поглощающего слоя (длина оптического пути), обычно 1 см.

Преимущества спектрофотометрического метода:

• Высокая чувствительность: Позволяет определять вещества в низких концентрациях. Минимальная концентрация, определяемая спектрофотометрическим методом, как правило, не ниже 10^-7 моль/л, что соответствует средней чувствительности по сравнению с другими аналитическими методами.
• Избирательность: Многие соединения имеют уникальные спектры поглощения, что позволяет идентифицировать их даже в смесях (после предварительного разделения или при использовании дифференциальной спектрофотометрии).
• Универсальность: Применим к широкому кругу органических и неорганических соединений, имеющих хромофорные группы.
• Относительная дешевизна: Спектрофотометры значительно дешевле и проще в эксплуатации, чем многие другие аналитические приборы.

Однако, спектрофотометрия может столкнуться с ограничениями в сложных биологических матрицах из-за интерференции других поглощающих веществ, что часто требует тщательной пробоподготовки.

Флуориметрия (флуоресцентная спектрофотометрия)

Флуориметрия, или флуоресцентная спектрофотометрия, представляет собой более чувствительный оптический метод, основанный на явлении флуоресценции. Принцип метода заключается в измерении света, испускаемого химическим веществом, которое переходит в возбуждённое состояние после поглощения световой энергии (возбуждающего излучения) и затем возвращается в основное состояние, испуская свет с другой длиной волны.

Ключевые особенности флуориметрии:

• Стоксов сдвиг: Как правило, длина волны флуоресцентного излучения больше длины волны возбуждения. Это явление, известное как Стоксов сдвиг, позволяет легко отделить возбуждающий свет от флуоресцентного, что значительно повышает специфичность метода.
• Высокая чувствительность: Флуориметрия в 10-100 раз чувствительнее абсорбционной спектрофотометрии. Это объясняется тем, что измеряется испускаемое излучение на фоне практически нулевого сигнала, в то время как в спектрофотометрии измеряется небольшое изменение интенсивности сильного падающего луча.
• Высокая специфичность: Флуоресцентными свойствами обладает ограниченный круг соединений, в основном ароматические, гетероциклические и карбонильные соединения, имеющие жесткую структуру и способные к эффективному излучательному переходу. Это уменьшает вероятность интерференции от нежелательных компонентов образца.

Примеры фармацевтических субстанций, определяемых методом флуориметрии:

• Аминокислоты: Фенилаланин, триптофан, тирозин.
• Алкалоиды: Стрихнин, резерпин, хинин.
• Витамины: Фолиевая кислота, рибофлавин, ретинола ацетат.
• Стероидные гормоны: Этинилэстрадиол.

Флуориметры активно используются для анализа концентрации лекарственных препаратов в крови или других биологических жидкостях, часто с использованием флуоресцентных молекул, которые специфически связываются с препаратами и светятся при определенных условиях. Несмотря на свою избирательность и высокую чувствительность, флуориметрия ограничена кругом флуоресцирующих соединений, что делает её менее универсальной, чем спектрофотометрия. Однако для подходящих аналитов она предоставляет неоспоримые преимущества. Неужели эти ограничения перевешивают её уникальные возможности в определенных нишах?

Хроматографические методы и масс-спектрометрия: от классики до высокотехнологичных подходов

Хроматография и масс-спектрометрия – это два столба современной аналитической химии, которые в синергии обеспечивают беспрецедентные возможности для биоанализа. От простых, но эффективных классических методов до сложнейших тандемных систем, эти технологии позволяют разделять, идентифицировать и количественно определять даже мельчайшие количества лекарственных средств и их метаболитов в сложнейших биологических матрицах. Изучение их эволюции и специфических преимуществ раскрывает всю глубину современного биоанализа.

Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Тонкослойная хроматография (ТСХ) – это один из старейших и наиболее доступных хроматографических методов, который, несмотря на появление более совершенных технологий, до сих пор широко используется в фармацевтическом анализе.

Принцип метода основан на различии в скорости перемещения компонентов смеси в тонком слое сорбента (например, силикагеля, оксида алюминия), нанесенного на инертную подложку (стеклянную пластину, алюминиевую фольгу), при движении подвижной фазы (растворителя) под действием капиллярных сил. Компоненты смеси разделяются в зависимости от их адсорбционной способности к стационарной фазе и растворимости в подвижной фазе. Чем сильнее вещество адсорбируется сорбентом и чем меньше его растворимость в подвижной фазе, тем медленнее оно перемещается.

Области применения ТСХ:

• Испытания на подлинность: Быстрая идентификация лекарственных средств путем сравнения R_f (фактора замедления) аналита со стандартом.
• Определение родственных примесей: Полуколичественное и количественное определение нежелательных примесей в фармацевтических субстанциях и готовых лекарственных формах.
• Контроль качества: Широко применяется в контроле лекарственных средств для терапевтической практики и ветеринарии.
• Определение витаминов: Используется для анализа водорастворимых и жирорастворимых витаминов.

Чувствительность ТСХ:

Метод позволяет обнаруживать до 0,025 мг лекарственного вещества. В сочетании с денситометрией (измерение оптической плотности пятен на хроматограмме) чувствительность увеличивается до 10^-7 г (0,1 мкг), а при использовании высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) может достигать 10^-9 г (1 нг). ТСХ ценна своей простотой, возможностью одновременного анализа множества образцов и низкой стоимостью, хотя её разрешение и точность уступают более сложным хроматографическим методам.

Газо-жидкостная хроматография (ГЖХ)

Газо-жидкостная хроматография (ГЖХ) — это мощный метод для разделения и количественного определения летучих и термически стабильных соединений.

Принцип действия основан на распределении компонентов смеси между газообразной подвижной фазой (газом-носителем, таким как гелий или азот) и жидкой неподвижной фазой, нанесенной на внутреннюю поверхность капиллярной колонки или на твердый носитель в насадочной колонке. При нагревании образца компоненты переходят в газовую фазу и переносятся газом-носителем через колонку. Разделение происходит из-за различий в их летучести и способности растворяться в неподвижной жидкой фазе.

Применение ГЖХ:

ГЖХ широко используется для определения микрограммовых и нанограммовых количеств лекарственных средств. Метод обеспечивает высокую эффективность разделения и чувствительность, особенно для соединений, которые могут быть легко испарены без разложения. Относительная погрешность при количественном определении составляет ± (8-15)% при содержании 10-25%. Для нелетучих или термически нестабильных соединений требуется предварительная дериватизация, что может усложнить процесс. ГЖХ часто применяется в токсикологии для определения наркотических веществ, алкоголя и других летучих соединений в биологических жидкостях.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) по праву считается «рабочей лошадкой» современной аналитической химии и биоанализа. Она стала незаменимым инструментом для широкого круга задач, от контроля качества до сложных биофармацевтических исследований.

Принцип метода заключается в разделении компонентов смеси, растворенных в жидкой подвижной фазе (элюенте), при их прохождении через колонку, заполненную мелкодисперсным сорбентом (неподвижной фазой) под высоким давлением. Разделение происходит за счет различий во взаимодействии компонентов с обеими фазами.

Преимущества и области применения ВЭЖХ:

• Универсальность: ВЭЖХ используется для скрининга, идентификации и количественного определения лекарственных препаратов и их метаболитов в биологических жидкостях. Подходит для анализа широкого спектра соединений, включая термолабильные и нелетучие, что является значительным преимуществом перед ГЖХ.
• Высокая точность и универсальность: Является незаменимым инструментом на всех этапах разработки и производства лекарственных препаратов, от синтеза активных фармацевтических субстанций до контроля готовой продукции.
• Биофармацевтические препараты: Применяется для анализа биофармацевтических препаратов, таких как белки, пептиды и антитела, где другие методы могут быть неэффективны.
• Экологический мониторинг: Используется для выявления загрязнений окружающей среды лекарственными соединениями.
• Сочетание с масс-спектрометрией: ВЭЖХ является идеальной платформой для сочетания с масс-спектрометрией (ЖХ-МС), что значительно расширяет её возможности по чувствительности, специфичности и идентификации.

Благодаря своей гибкости в выборе фаз, детекторов и высокой эффективности разделения, ВЭЖХ остается одним из наиболее востребованных методов в биоанализе.

Масс-спектрометрия (МС) и тандемная МС (МС-МС)

Масс-спектрометрия (МС) – это революционный аналитический метод, который изменил подходы к изучению химических и биологических систем. Это физический метод измерения отношения массы заряженных частиц (ионов) к их заряду (m/z).

Принцип МС:

1. Ионизация: Молекулы аналита сначала ионизируются, приобретая электрический заряд.
2. Разделение: Образовавшиеся ионы ускоряются и затем разделяются в магнитном или электрическом поле по отношению m/z.
3. Детектирование: Детектор регистрирует количество ионов каждого m/z.

Результатом является масс-спектр, представляющий собой зависимость интенсивности ионного тока от m/z, который служит «молекулярным отпечатком» вещества.

Преимущества МС:

• Высокая чувствительность: Пределы обнаружения для неорганических веществ (например, металлов) методом ICP-MS могут достигать 1·10^-15 г (одна доля на квадриллион). Это позволяет обнаруживать ничтожные количества веществ.
• Высокая скорость: Современные времяпролетные масс-спектрометры способны регистрировать до 40 000 масс-спектров в секунду, что делает их одними из самых быстрых аналитических приборов.
• Информативность: Позволяет не только определить точную массу соединения, но и получить информацию о его структуре через анализ фрагментации ионов.
• Универсальность: Применима для анализа химических и биологических соединений любой сложности, от малых молекул до крупных биополимеров.

Тандемная масс-спектрометрия (МС-МС, или МС²) представляет собой усовершенствование МС, где два или более масс-спектрометра соединены последовательно.

Принцип МС-МС:

1. Первый масс-анализатор: Выделяет «родительские» ионы (прекурсоры) целевого соединения из сложной смеси по их m/z.
2. Фрагментация: Выделенные родительские ионы подвергаются контролируемой фрагментации (например, путем столкновения с молекулами инертного газа) для образования «дочерних» ионов.
3. Второй масс-анализатор: Анализирует m/z образовавшихся дочерних ионов.

Применение МС-МС:

Этот метод обеспечивает беспрецедентную специфичность и чувствительность. Он используется для структурного анализа, идентификации веществ в составе смесей, а также для точного количественного определения. Например, если в образце присутствует несколько соединений с одинаковой массой, МС-МС может их различить по уникальным фрагментационным паттернам. ЖХ-МС/МС, сочетающая разделяющую способность жидкостной хроматографии с мощью тандемной масс-спектрометрии, является золотым стандартом для обнаружения и количественного определения лекарственных средств и метаболитов в биологических матрицах, особенно в исследованиях in vitro и in vivo, в клинической токсикологии и терапевтическом мониторинге.

Комбинированные аналитические подходы: современные стандарты биоанализа

В условиях постоянно растущих требований к чувствительности, специфичности, скорости и способности анализировать сложные биологические матрицы, индивидуальные аналитические методы часто оказываются недостаточными. Именно поэтому комбинированные аналитические подходы, объединяющие мощные разделительные методы с высокочувствительными детекторами, стали краеугольным камнем современного биоанализа. Среди них особое место занимают жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС) и её более продвинутая версия – жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС). Эти системы являются золотым стандартом в исследованиях метаболизма лекарственных средств и фармакокинетики (DMPK), обеспечивая беспрецедентную точность и глубину анализа.

Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС) и тандемная МС (ЖХ-МС/МС)

ЖХ-МС и ЖХ-МС/МС представляют собой мощное сочетание, где высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для разделения сложных смесей, а масс-спектрометрия (одиночная или тандемная) – для высокочувствительной и специфичной идентификации и количественного определения разделенных компонентов.

Принцип синергии:

• ВЭЖХ: Разделяет сотни или тысячи компонентов биологической матрицы, уменьшая влияние мешающих веществ на масс-спектрометрический детектор. Это позволяет анализировать вещества с высокой точностью даже в присутствии других соединений с похожими физико-химическими свойствами.
• МС/МС: После разделения ВЭЖХ, каждый компонент последовательно поступает в масс-спектрометр. Тандемная масс-спектрометрия (МС/МС) обеспечивает дополнительный уровень специфичности, поскольку она не только измеряет массу исходного иона (родительского), но и его фрагментов (дочерних ионов). Это подтверждает идентичность соединения и позволяет надежно отличать его от изомеров или других веществ с одинаковой молекулярной массой.

Применение ЖХ-МС/МС в DMPK-исследованиях, клинической токсикологии и ТЛМ:

• DMPK-исследования: ЖХ-МС/МС является основным инструментом для изучения всасывания, распределения, метаболизма и выведения лекарственных средств и их метаболитов. Она позволяет точно определять концентрации соединений на всех этапах фармакокинетического профиля.
• Клиническая токсикология: Высокая чувствительность и специфичность ЖХ-МС/МС делают её идеальной для обнаружения и количественного определения наркотических средств, психотропных веществ, их метаболитов и других токсикантов в биологических жидкостях. Метод позволяет проводить анализ более 500 наркотических соединений и их метаболитов за один анализ.
• Терапевтический лекарственный мониторинг (ТЛМ): Точное измерение концентраций лекарственных препаратов с узким терапевтическим окном является критически важным. ЖХ-МС/МС активно применяется для терапевтического мониторинга иммунодепрессантов (такролимус, сиролимус, циклоспорин, эверолимус), антиконвульсантов, антиретровирусных препаратов и антикоагулянтов, обеспечивая индивидуальный подход к дозированию.

Преимущества ЖХ-МС/МС:

• Высокая чувствительность: Позволяет обнаруживать малые количества аналитов (менее нанограмма). Пределы обнаружения для многих соединений достигают 0,01–0,05 нг/мл, что значительно превосходит возможности иммунологических методов и классической ВЭЖХ для низкомолекулярных соединений.
• Уникальная специфичность: Двойной масс-анализ обеспечивает высокую избирательность, минимизируя влияние матричных эффектов и интерференций.
• Одновременный анализ множества целевых соединений: Метод позволяет проводить мультикомпонентный анализ, что особенно ценно в скрининговых исследованиях. Например, скрининг новорожденных на врожденные ошибки метаболизма может выявить несколько десятков заболеваний за один анализ.
• Высокая скорость анализа: Благодаря применению коротких аналитических колонок и быстрых детекторов, современные ЖХ-МС/МС системы способны обрабатывать 500 и более образцов в сутки для некоторых видов анализов, что обеспечивает высокую пропускную способность.

По сравнению с ранее используемыми методами оптической и ИК-спектроскопии, а также с иммунологическими методами, ЖХ-МС/МС значительно превосходит их по чувствительности, специфичности и экспрессности. Она позволяет анализировать сложные смеси и обнаруживать микропримеси, которые были бы незаметны другими методами. Этот комбинированный подход является воплощением современного биоанализа, предоставляя глубокие и надежные данные для развития фармацевтической науки и персонализированной медицины.

Иммунохимические методы: специфичность и высокая пропускная способность

Наряду с физико-химическими методами, в биоанализе лекарственных средств и их метаболитов важное место занимают иммунохимические подходы. Эти методы используют уникальную способность антител специфически связываться с антигенами, что обеспечивает высокую селективность анализа даже в сложных биологических матрицах. Среди них наиболее распространенным и хорошо зарекомендовавшим себя является иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Детальное рассмотрение ИФА позволяет оценить его принципы, преимущества и, что не менее важно, ограничения, что дает полную картину возможностей метода.

Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA)

Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA — Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) — это широко используемый лабораторный иммунологический метод, предназначенный для качественного или количественного определения различных соединений: от низком��лекулярных веществ до макромолекул и даже вирусов. Его фундамент – это высокоспецифичная реакция антиген-антитело.

Принцип метода:

1. Специфическое связывание: В основе ИФА лежит образование комплекса «антиген-антитело». Антиген (аналит) связывается со специфическим антителом, иммобилизованным на твердой фазе (например, на дне лунки микропланшета).
2. Ферментативная метка: Для выявления образовавшегося комплекса используется вторичное антитело, конъюгированное с ферментом (например, пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).
3. Детекция сигнала: После добавления специфического субстрата фермент катализирует реакцию, приводящую к образованию окрашенного продукта, интенсивность которого пропорциональна количеству связанного антигена. Сигнал регистрируется спектрофотометрически.

Преимущества ИФА:

• Уникальная специфичность: Антитела обладают высокой способностью точно узнавать «свои» антигены, что минимизирует ложноположительные реакции от других компонентов матрицы.
• Высокая чувствительность: ИФА сочетает специфичность иммунохимической реакции с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки, позволяя обнаруживать аналиты вплоть до 10^-21 моль в образце. Обнаружение от 0,01 до 0,1 нг искомого вещества.
• Минимальные объемы образца: Для анализа требуется очень небольшое количество биологического материала.
• Стабильность реагентов: Реагенты для ИФА обычно стабильны и имеют длительный срок хранения.
• Простота проведения реакции: Методика ИФА относительно проста в освоении и выполнении.
• Возможность автоматизации: Процессы ИФА легко автоматизируются, что делает метод высокопроизводительным.
• Относительно низкая стоимость: Диагностические наборы для ИФА часто более доступны по сравнению с реагентами для масс-спектрометрии.
• Высокая пропускная способность: ИФА обеспечивает высокую пропускную способность, позволяя анализировать более 100 образцов в день, что значительно выше по сравнению с хроматографическими методами (которые обычно обрабатывают 10-20 образцов в день).
• Минимальная пробоподготовка: Для многих ИФА-тестов не требуется дополнительного изолирования и очистки образцов, поскольку реакция проводится непосредственно в биожидкости.

Примеры применения ИФА для определения лекарственных веществ и их метаболитов:

ИФА широко используется для скрининга и количественного определения различных лекарственных препаратов и их метаболитов, особенно в токсикологии и наркологии.

• Опиаты (морфин, героин): Порог обнаружения 10-50 нг/мл.
• Каннабиноиды (ТГК): Порог обнаружения 25-50 нг/мл.
• Амфетамины: Порог обнаружения 50-100 нг/мл.
• Бензодиазепины: Порог обнаружения 10-50 нг/мл.
• Кокаин: Порог обнаружения 50-100 нг/мл.
• Барбитураты: Порог обнаружения 100-200 нг/мл.

Метод также используется для контроля качества биологических лекарственных препаратов и определения таких веществ, как HBs-антиген, HAV-антиген, антиген вируса клещевого энцефалита, полио D-антиген, ингибин бета, интерферон альфа и гентамицин.

Недостатки и ложноположительные результаты:

Несмотря на высокую специфичность, ИФА может давать ложноположительные результаты в определенных ситуациях. Это может быть связано с:

• Наличием ревматоидного фактора: Эти аутоантитела могут интерферировать с реакцией антиген-антитело.
• Системными заболеваниями: Некоторые аутоиммунные или воспалительные состояния могут влиять на результаты.
• Нарушениями обменных процессов.
• Приемом некоторых лекарственных препаратов: Определенные лекарства могут перекрестно реагировать с антителами или влиять на ферментативную реакцию.
• У новорожденных детей: Наличие материнских антител или особенности иммунной системы новорожденных могут приводить к искажениям.

Таким образом, ИФА является ценным инструментом для скрининга и количественного определения, особенно там, где требуется высокая пропускная способность и минимальная пробоподготовка, но его результаты всегда должны интерпретироваться с учетом возможных интерференций и подтверждаться более специфичными методами, особенно в клинически значимых случаях.

Регуляторные требования и аспекты контроля качества: обеспечение надежности биоаналитических данных

Точность и надежность биоаналитических данных — это не просто научное достижение, но и строго регулируемый процесс, обеспечивающий безопасность и эффективность лекарственных средств. Без строгих регуляторных требований и безукоризненного контроля качества результаты исследований теряют свою ценность, а доверие к лекарственным препаратам подрывается. Валидация биоаналитических методик является ключевым элементом этой системы, гарантируя, что любой метод, используемый для количественного определения лекарственных средств и их метаболитов в биологических жидкостях, соответствует самым высоким стандартам.

Валидация биоаналитических методик

Основная цель валидации биоаналитической методики заключается в подтверждении её надежности, пригодности и воспроизводимости для точного определения концентрации анализируемого вещества (лекарственного средства и/или его метаболитов) в различных биологических образцах, таких как кровь, сыворотка, плазма, моча и слюна. Этот процесс является критически важным для всех этапов разработки и применения лекарственных препаратов.

Применение валидированных методик:

Биоаналитические методики, прошедшие валидацию, используются в основном при проведении:

• Фармакокинетических исследований: Определение профилей ADME (всасывание, распределение, метаболизм, выведение).
• Исследований биоэквивалентности: Сравнение скорости и степени всасывания двух лекарственных форм одного и того же действующего вещества.
• Токсикокинетических исследований: Изучение кинетики токсических веществ в организме.
• Изучении метаболизма: Идентификация и количественное определение метаболитов лекарственных средств.

Виды валидации и условия их проведения:

1. Полная валидация: Проводится при разработке абсолютно новой биоаналитической методики. Это наиболее полный и всеобъемлющий процесс, охватывающий все аспекты метода.
2. Частичная валидация: Проводится в случаях, когда в уже валидированную методику вносятся незначительные изменения. Например, при смене лаборатории, оборудования (аналогичного типа), изменении объемов образцов, условий хранения проб, или при расширении диапазона концентраций. Частичная валидация подтверждает, что изменения не повлияли на критические параметры метода.
3. Кросс-валидация: Проводится для сравнения результатов, полученных двумя разными лабораториями или двумя разными методами для одних и тех же образцов. Это обеспечивает сопоставимость данных между различными исследованиями или учреждениями.

Основные параметры валидации

Валидация аналитических методик проводится в соответствии с действующими нормативными требованиями, которые регламентированы такими документами, как Руководство по экспертизе лекарственных средств, рекомендации FDA Bioanalytical Method Validation и Правила проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках ЕАЭС.

Ключевые параметры валидации биоаналитических методов включают:

1. Селективность (Selectivity/Specificity): Способность метода однозначно определять аналит без помех от других компонентов биологической матрицы (эндогенных веществ, метаболитов, других совместно применяемых лекарств).
2. Нижний предел количественного определения (НПКО, LLOQ — Lower Limit of Quantification): Наименьшая концентрация аналита, которую можно точно и прецизионно количественно определить. Для НПКО в валидированных методиках требуются высокие показатели точности и воспроизводимости. Например, в одном из исследований для НПКО была продемонстрирована точность <20% и воспроизводимость (относительное стандартное отклонение) <15%.
3. Линейность (Linearity): Характеризует пропорциональность между откликом прибора (например, пиковой площадью в хроматографии) и концентрацией аналита в заданном рабочем диапазоне.
4. Правильность (Accuracy): Степень близости полученного результата к истинному или принятому опорному значению. Выражается в процентах отклонения от номинальной концентрации.
5. Прецизионность (Precision): Степень близости между результатами независимых измерений, выполненных в одних и тех же или заданных условиях. Оценивается как внутридневная (повторяемость) и междневная (воспроизводимость) прецизионность.
6. Эффект переноса (Carry-over): Наличие аналита в образце, следующем за образцом с высокой концентрацией, из-за неполного вымывания из аналитической системы.
7. Эффект матрицы (Matrix effect): Влияние компонентов биологической матрицы (не аналита и внутреннего стандарта) на отклик аналита, которое может привести к подавлению или усилению сигнала.
8. Степень извлечения (Recovery): Эффективность извлечения аналита из биологической матрицы в процессе пробоподготовки.
9. Тест на разведение (Dilution integrity): Способность точно и прецизионно определить концентрации аналита в образцах, которые были разбавлены из-за очень высокой исходной концентрации.
10. Оценка минимальных откликов аналита и внутреннего стандарта: Важно для подтверждения стабильности и надежности сигналов.
11. Обратная конверсия метаболитов (если применимо): Проверка того, не превращается ли метаболит обратно в исходное лекарственное средство в процессе хранения или анализа.

При исследовании комбинированных лекарственных форм проводятся отдельные валидационные тесты по влиянию совместного присутствия нескольких веществ в анализируемых образцах, чтобы исключить взаимное влияние на количественное определение.

Регуляторные документы и гармонизация

Современные биоаналитические исследования подчиняются строгим международным и национальным регуляторным требованиям. Ключевые документы включают:

• Руководство по экспертизе лекарственных средств.
• Рекомендации FDA Bioanalytical Method Validation (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США).
• Правила проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза (ЕАЭС).

Наблюдается активная гармонизация регуляторных требований различных юрисдикций. Требования нового руководства FDA 2018 года в целом согласуются с документом ЕАЭС, несмотря на некоторые отличия в количестве параметров и критериях их приемлемости. Среди ключевых изменений в руководстве FDA 2018 года отмечается:

• Объединение требований к валидации хроматографических методик и методик связывания лиганда (например, ИФА).
• Включение валидации биомаркеров, что расширяет область применения биоаналитических методов.
• Выделение раздела для новых технологий, таких как метод сухой капли крови (DBS — Dried Blood Spot), который позволяет собирать образцы крови на фильтровальной бумаге, упрощая логистику и уменьшая инвазивность.
• Введение концепции «соответствия поставленным целям» (fit-for-purpose), что позволяет гибко подходить к валидации в зависимости от стадии исследования и критичности данных.

Эти изменения способствуют общей гармонизации с требованиями ЕАЭС, что упрощает проведение международных исследований и взаимное признание биоаналитических данных, обеспечивая единство и высокое качество в мировом фармацевтическом сообществе. Это означает, что данные, полученные в одной стране, могут быть приняты регуляторами в другой, значительно ускоряя процессы разработки и регистрации лекарственных средств.

Заключение

Путешествие в мир методов количественного определения лекарственных средств и их метаболитов в биологических жидкостях раскрывает перед нами не просто набор лабораторных техник, а сложную и динамичную область на стыке фармацевтической и аналитической химии. От фундаментальных оптических методов, таких как спектрофотометрия и флуориметрия, предлагающих универсальность и высокую чувствительность для специфических соединений, до классических хроматографических подходов – ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ, каждый из которых имеет свои ниши применения.

Истинное могущество биоанализа проявляется в синергии комбинированных подходов, в первую очередь жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) и тандемной ЖХ-МС/МС. Эти методы, объединяющие высокую разделительную способность с беспрецедентной чувствительностью и специфичностью масс-спектрометрии, стали краеугольным камнем в исследованиях фармакокинетики, метаболизма лекарственных средств, клинической токсикологии и терапевтического лекарственного мониторинга. Они позволяют не только обнаруживать ничтожные количества аналитов, но и идентифицировать их в сложнейших биологических матрицах, преодолевая ограничения, присущие индивидуальным методам.

Иммунохимические методы, такие как ИФА, дополняют этот арсенал, предлагая высокую пропускную способность и специфичность для определенных классов соединений, часто с минимальной пробоподготовкой, что делает их незаменимыми для скрининговых исследований.

Однако, каким бы совершенным ни был аналитический инструмент, его ценность определяется надежностью получаемых данных. Именно здесь в игру вступают строгие регуляторные требования и процессы валидации биоаналитических методик. Селективность, чувствительность, точность, прецизионность, линейность и другие параметры валидации, регламентированные международными и национальными стандартами, обеспечивают бесспорную достоверность результатов. Гармонизация этих требований, как показано на примере руководств FDA и ЕАЭС, является критически важной для глобальной фармацевтической индустрии и клинической практики.

В конечном итоге, всесторонний и обоснованный подход к выбору и валидации аналитических методов является фундаментальным для обеспечения точности, надежности и безопасности получаемых биоаналитических данных. Это не только способствует разработке новых, более эффективных и безопасных лекарственных препаратов, но и лежит в основе персонализированной медицины, позволяя оптимизировать терапию для каждого пациента и обеспечить эффективный терапевтический мониторинг. Будущее биоанализа обещает дальнейшее совершенствование существующих технологий и появление новых, еще более чувствительных и быстрых методов, что продолжит трансформировать подходы к пониманию и управлению лекарственной терапией.

Список использованной литературы

1. Царев Н.И., Царев В.И., Катраков И.Б. Практическая газовая хроматография: Учебно-методическое пособие для студентов химического факультета по спецкурсу «Газохроматографические методы анализа». Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2000. 156 с.
2. Жерносек А.К., Талуть И.Е. Аналитическая химия для будущих провизоров. Часть 1. Учебное пособие / Под ред. А.И. Жебентяева. Витебск: ВГМУ, 2003. 362 с.
3. Введение в хроматографический анализ: методические разработки для студентов V курса фармацевтического факультета. Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2005.
4. Кокорина Н. О., Новоселов В. П., Ханина М. А. Определение лекарственных препаратов в биожидкостях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // СМЖ (Томск). 2008. №4-2. С.51-53.
5. Эммануэль Н. М., Кузьмин М. Г. (ред.) Экспериментальные методы химической кинетики: газожидкостная хроматография. Учебн. пособие. Москва: Изд-во Московского университета, 1985.
6. Обзор требований к валидации биоаналитических методик. Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина». URL: https://cyberleninka.ru/article/n/obzor-trebovaniy-k-validatsii-bioanaliticheskih-metodik (дата обращения: 28.10.2025).
7. Требования к валидации биоаналитических методик испытаний и анализу исследуемых биологических образцов. URL: https://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_398075/d8c115456c60e58804c85675003554b732fb6c91/ (дата обращения: 28.10.2025).
8. Приложение № 6 Требования к валидации биоаналитических методик испытаний и анализу исследуемых биологических образцов. URL: https://фармакопея.рф/приложение-№-6-требования-к-валидации-биоаналитических-методик-испытаний-и-анализу-исследуемых-биологических-образцов/ (дата обращения: 28.10.2025).
9. Современные регуляторные требования FDA к валидации биоаналитических методик в сравнении с требованиями ЕАЭС // Pharmjournal.ru. URL: https://pharmjournal.ru/articles/sovremennye-regulyatornye-trebovaniya-fda-k-validatsii-bioanaliticheskih-metodik-v-sravnenii-s-trebovaniyami-eaes (дата обращения: 28.10.2025).
10. Теория и практика твердофазной экстракции. URL: https://www.tfa-online.ru/articles/teoriya-i-praktika-tverdofaznoy-ekstraktsii (дата обращения: 28.10.2025).
11. Валидация биоаналитических методик // Quintanalytica.ru. URL: https://quintanalytica.ru/services/bioanalytical-method-validation/ (дата обращения: 28.10.2025).
12. Применение тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МСМС) в клинической диагностике // Biofarmexpert.ru. URL: https://biofarmexpert.ru/articles/primenenie-tandemnoy-mass-spektrometrii-vezhkh-msms-v-klinicheskoy-diagnostike (дата обращения: 28.10.2025).
13. ИФА, ИХЛА, МС — Новая лаборатория // Newlab.pro. URL: https://newlab.pro/articles/ifa-ihla-ms (дата обращения: 28.10.2025).
14. Масс спектрометрия применяется на многих стадиях фармацевтических исследований. URL: https://echem.ru/journal/spectrometry/ms-pharmacy (дата обращения: 28.10.2025).
15. Количественное определение лекарственных средств в биологических жидкостях (фармакокинетические исследования лекарственных средств) // Studfile.net. URL: https://studfile.net/preview/7918843/page:6/ (дата обращения: 28.10.2025).
16. Иммуноферментный анализ, показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы // Invitro.ru. URL: https://www.invitro.ru/analizes/for-doctors/452/23610/ (дата обращения: 28.10.2025).
17. Тонкослойная хроматография // Pharmacopoeia.ru. URL: https://www.pharmacopoeia.ru/pharmacopoeia/XIV/HTML/1271.html (дата обращения: 28.10.2025).
18. Масс-спектрометрия в медицине // Medicine.nethouse.ru. URL: https://medicine.nethouse.ru/articles/583737 (дата обращения: 28.10.2025).
19. Тонкослойная хроматография (ТСХ) — статьи по оборудованию ПЕТРОЛАЗЕР // Petrolaser.ru. URL: https://petrolaser.ru/articles/tonkoslojnaya-khromatografiya-tkh/ (дата обращения: 28.10.2025).
20. Илларионова Е.А., Сыроватский И.П. Основы метода масс-спектрометрии. Практическое применение метода. Иркутск, 2021. 49 с. URL: https://irkgmu.ru/assets/files/nauka/izdaniya/uchebnye-posobiya/illarionova-e.a.-syrovatskiy-i.p.-osnovy-metoda-mass-spektrometrii.-prakticheskoe-primenenie-metoda.-uch.posob.-irkutsk-2021.-49-s.pdf (дата обращения: 28.10.2025).
21. Твердофазная экстракция. URL: https://www.rea.ru/ru/org/managements/centr-kollektivnogo-polzovaniya/Documents/%D0%9E%D0%B1%D0%B7%D0%BE%D1%80%D1%8B%20%D0%B8%20%D1%81%D1%82%D0%B0%D1%82%D1%8C%D0%B8/%D0%A2%D0%B2%D0%B5%D1%80%D0%B4%D0%BE%D1%84%D0%B0%D0%B7%D0%BD%D0%B0%D1%8F%20%D1%8D%D0%BA%D1%81%D1%82%D1%80%D0%B0%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F.pdf (дата обращения: 28.10.2025).
22. Иммуноферментный метод анализа. Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина». URL: https://cyberleninka.ru/article/n/immunofermentnyy-metod-analiza (дата обращения: 28.10.2025).
23. Тонкослойная хроматография. URL: https://gmp.su/wp-content/uploads/2016/06/%D0%A2%D0%BE%D0%BD%D0%BA%D0%BE%D1%81%D0%BB%D0%BE%D0%B9%D0%BD%D0%B0%D1%8F-%D1%85%D1%80%D0%BE%D0%BC%D0%B0%D1%82%D0%BE%D0%B3%D1%80%D0%B0%D1%84%D0%B8%D1%8F.pdf (дата обращения: 28.10.2025).
24. Определение лекарственных препаратов в биожидкостях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина». URL: https://cyberleninka.ru/article/n/opredelenie-lekarstvennyh-preparatov-v-biozhidkostyah-metodom-vysokoeffektivnoy-zhidkostnoy-hromatografii (дата обращения: 28.10.2025).
25. Журнал аналитической химии, 2019, T. 74, № 3, стр. 163-172. URL: https://www.maik.ru/abstract/ran/jac/74/jac0163_abstract.pdf (дата обращения: 28.10.2025).
26. ИФА: что это и какие болезни можно выявить с его помощью // Journal.tinkoff.ru. URL: https://journal.tinkoff.ru/ifa/ (дата обращения: 28.10.2025).
27. Спектрофотометрия и фотоэлектроколориметрия в анализе лекарственных средств // Pandia.ru. URL: https://www.pandia.ru/text/78/355/12.php (дата обращения: 28.10.2025).
28. Валидация аналитических методик — онлайн практикум | Лабораторные темы | Лаборатория качества. URL: https://www.youtube.com/watch?v=R9N2Bf0Jt0E (дата обращения: 28.10.2025).
29. Валидация методик анализа, ч.1: основы. URL: https://www.youtube.com/watch?v=Pt6zxQkyI0w (дата обращения: 28.10.2025).
30. Валидация и верификация методов химического анализа. Особенности валидации методик ИФА. URL: https://www.youtube.com/watch?v=S016S3Kz87Q (дата обращения: 28.10.2025).
31. Валидация методик анализа, ч.3: точность. URL: https://www.youtube.com/watch?v=r0Xg-5g5uEw (дата обращения: 28.10.2025).
32. Методы анализа лекарственных препаратов // Bibliofond.ru. URL: https://bibliofond.ru/view.aspx?id=516664 (дата обращения: 28.10.2025).
33. Особенности биофармацевтического анализа — Анализ лекарственных веществ в биологических жидкостях // Studbooks.net. URL: https://studbooks.net/83541/meditsina/osobennosti_biofarmatsevticheskogo_analiza (дата обращения: 28.10.2025).
34. Теория и практика хроматографии. URL: http://www.chromatogramma.ru (дата обращения: 28.10.2025).
35. Физико-химические методы анализа. Хроматографические методы анализа. URL: http://www.chem-astu.ru/chair/study/PCMA/r3_1.htm (дата обращения: 28.10.2025).