Роль ионов кальция в молекулярном механизме утраты полипотентности стволовых клеток

В мире биологии существует феномен, который продолжает завораживать исследователей и давать надежду на прорывы в медицине: способность эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) млекопитающих не только неограниченно поддерживать свое недифференцированное состояние, но и трансформироваться во все три зародышевых листка, порождая более 200 типов клеток взрослого организма. Эти удивительные свойства — самообновление и плюрипотентность — лежат в основе регенеративной медицины и фундаментальной биологии развития. Однако эта невероятная пластичность находится под угрозой. Утрата полипотентности — процесс, в ходе которого стволовая клетка теряет свою универсальность и необратимо движется по пути дифференцировки — является ключевой проблемой, которую необходимо понять и научиться контролировать.

В этом сложном танце клеточных судеб, где каждый шаг может решить, останется ли клетка «чистым листом» или станет специализированным элементом ткани, ионы кальция (Ca²⁺) выступают в роли невидимого, но всемогущего дирижера. Эти крошечные, но чрезвычайно активные заряженные частицы являются универсальными сигнальными посредниками, оркеструющими бесчисленные внутриклеточные процессы: от транскрипции генов и клеточного деления до дифференцировки и даже запрограммированной клеточной смерти. Понимание того, как Ca²⁺-сигнализация интегрируется с генетическими и эпигенетическими механизмами поддержания полипотентности, становится краеугольным камнем для разработки новых терапевтических стратегий. Это означает, что если мы хотим эффективно управлять судьбой стволовых клеток для лечения заболеваний, нам необходимо мастерски владеть «кальциевым кодом».

Данный реферат ставит своей целью систематизировать и углубить знания о многогранной роли ионов кальция в молекулярном механизме утраты полипотентности стволовых клеток. Мы рассмотрим, как Ca²⁺ влияет на структуру нуклеиновых кислот и хроматина, какие кальций-зависимые сигнальные пути и белки регулируют дифференцировку, и какие гипотезы объясняют необратимую потерю плюрипотентности. Особое внимание будет уделено тем «слепым зонам» в текущих исследованиях, которые требуют дополнительного анализа, чтобы представить максимально полную картину этого критически важного биологического процесса.

Полипотентность стволовых клеток: Основы, маркеры и механизмы поддержания

Путешествие в мир стволовых клеток начинается с их уникальной способности к «самообновлению» и «плюрипотентности». Это два столпа, на которых зиждется их исключительное значение в биологии и медицине. Самообновление позволяет клеткам делиться, не теряя своего недифференцированного статуса, сохраняя тем самым неисчерпаемый источник для обновления тканей. Плюрипотентность же означает их потенциал превращаться практически в любой тип клеток взрослого организма, от нейронов до кардиомиоцитов, формируя все три зародышевых листка: эктодерму, энтодерму и мезодерму. Почему так важна эта их универсальность? Потому что именно она дает ключ к регенерации поврежденных тканей и органов, предлагая надежду на лечение неизлечимых заболеваний.

Определение и виды полипотентности

В биологическом словаре плюрипотентность (от лат. plurimus — очень многие и potentia — возможность) означает способность клетки дифференцироваться во все типы клеток взрослого организма, за исключением внеэмбриональных тканей (плаценты). Это отличает их от тотипотентных клеток (например, зиготы), которые могут формировать и внеэмбриональные структуры. Основными моделями для изучения плюрипотентности являются эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК).

ЭСК, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются естественным источником плюрипотентности. иПСК, в свою очередь, представляют собой революционное достижение современной биологии, поскольку они создаются искусственно путем репрограммирования соматических клеток взрослого организма. Несмотря на различия в происхождении, иПСК обладают схожими функциональными характеристиками и маркерами плюрипотентности с ЭСК, что делает их бесценным инструментом для исследований и потенциальных терапевтических применений.

Генетические регуляторы плюрипотентности

Поддержание плюрипотентного состояния — это сложный молекулярный танец, где главные роли играют ключевые транскрипционные факторы. Триумвират Oct4, Sox2 и Nanog является краеугольным камнем этой системы. Их одновременная экспрессия наблюдается исключительно в плюрипотентных клетках, и любое нарушение в их работе, будь то нокаут гена или изменение уровня экспрессии, неминуемо ведет к дифференцировке клеток.

Таблица 1: Ключевые транскрипционные факторы и их роль в плюрипотентности

Транскрипционный фактор	Роль в поддержании плюрипотентности	Последствия нокаута
Oct4	Необходим для поддержания недифференцированного состояния, регулирует гены самообновления и подавляет гены дифференцировки.	Ранняя дифференцировка ЭСК в трофобластные клетки in vitro; нарушения развития эмбриона на ранних стадиях (неспособность к формированию внутренней клеточной массы) in vivo.
Sox2	Действует синергично с Oct4, образуя комплексы, которые активируют гены плюрипотентности и подавляют гены дифференцировки.	Дифференцировка ЭСК in vitro; нарушения развития эмбриона (летальность на ранних стадиях, дефекты нервной системы) in vivo.
Nanog	Поддерживает плюрипотентность независимо от Oct4/Sox2, предотвращая спонтанную дифференцировку, регулирует экспрессию генов, связанных с самообновлением.	Дифференцировка ЭСК в клетки эпибласта in vitro; нарушения развития эмбриона (дефекты мезодермы и энтодермы, летальность) in vivo.

Помимо этих центральных факторов, плюрипотентность регулируется сложной сетью сигнальных путей:

• Путь STAT3: Активация STAT3 способствует поддержанию плюрипотентности, в частности, через активацию KLF4, который, в свою очередь, регулирует экспрессию Sox2.
• Путь фосфатидилинозитол-3-ОН-киназы (PI3K/Akt): Этот путь играет важную роль в активации TBX3, который способствует активации Nanog и поддержанию плюрипотентности. Ингибиторы митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) также могут усиливать этот эффект.
• Сигнальный путь TGF-β/Nodal/Activin: Этот путь критически важен для поддержания плюрипотентного статуса ЭСК и подавления их спонтанной дифференцировки.

Эпигенетическая регуляция плюрипотентности

Гены не работают в вакууме. Их активность тонко настраивается эпигенетическими механизмами — изменениями в экспрессии генов, не затрагивающими последовательность ДНК. В плюрипотентных клетках эти механизмы играют ключевую роль, создавая уникальное состояние хроматина, которое определяет их идентичность.

Основные игроки эпигенетической регуляции:

1. Модификации хроматина:
   • Белки группы Polycomb: Эти белки формируют репрессорные комплексы (PRC1 и PRC2), которые модифицируют гистоны, в частности, добавляя метильные группы к лизину 27 гистона H3 (H3K27me3). Эта модификация ассоциирована с подавлением экспрессии генов дифференцировки, сохраняя их в «молчащем», но «готовом» состоянии.
   • АТФ-зависимые комплексы перестройки хроматина: К ним относятся ДНК-связывающий белок с геликазным хромодоменом Chd1 и фактор транскрипции BAF (rg/Brahma-associated factors). Эти комплексы используют энергию АТФ для изменения нуклеосомной структуры, делая ДНК более или менее доступной для транскрипционных факторов. В плюрипотентных клетках они способствуют поддержанию открытой, транскрипционно активной структуры хроматина в ключевых генах плюрипотентности.
2. Метилирование ДНК:
   • ДНК-метилтрансферазы (ДНМТ1, ДНМТ3А/В): Эти ферменты добавляют метильные группы к цитозиновым остаткам в CpG-динуклеотидах. Высокий уровень CpG-метилирования промоторных участков часто ассоциирован с подавлением генной экспрессии. В плюрипотентных клетках существует особый паттерн метилирования, включая метилирование вне CpG-динуклеотидов, которое важно для способности к дифференцировке.
   • Ферменты TET1/2/3: Эти диоксигеназы катализируют окислительное деметилирование ДНК, превращая 5-метилцитозин в 5-гидроксиметилцитозин, что является первым шагом в активном деметилировании. Они играют роль в динамической регуляции метилирования ДНК в плюрипотентных клетках.
3. Модификации гистонов:
   • Ацетилирование/Деацетилирование: Гистон-ацетилтрансферазы (ГАТ) добавляют ацетильные группы к лизиновым остаткам гистонов, что ослабляет взаимодействие гистонов с ДНК и «открывает» хроматин, способствуя активации генов. Гистон-деацетилазы (ГДАЦ) удаляют эти группы, «закрывая» хроматин. Ингибиторы ГДАЦ (например, вальпроевая кислота) могут повышать эффективность репрограммирования, способствуя активации плюрипотентных генов.
   • Метилирование/Деметилирование: Гистон-метилтрансферазы (ГМТ) и гистон-деметилазы (ГДМ) регулируют метилирование гистонов, которое может как активировать (например, H3K4me3), так и репрессировать (например, H3K9me3, H3K27me3) гены. «Двуцветные» домены с H3K4me3 и H3K27me3 характерны для ЭСК и поддерживают гены развития в «готовом» состоянии для быстрой активации.

Эпигенетическая «память» иПСК: Одной из ключевых проблем иПСК является сохранение «эпигенетической памяти» исходных соматических клеток. Это означает, что даже после репрограммирования иПСК могут нести на себе остаточные эпигенетические метки, которые отличают их от ЭСК и могут ограничивать их дифференцировочный потенциал в определенных клеточных линиях. Например, иПСК могут иметь дифференциально метилированные области (ДМО) по сравнению с ЭСК и соматическими клетками. Устранение этой «памяти» достигается длительным культивированием или использованием агентов, перестраивающих структуру хроматина, таких как комплексы Chd1 и BAF, которые способствуют связыванию факторов репрограммирования с генами-мишенями.

Функциональные тесты и маркеры плюрипотентности

Для подтверждения истинной плюрипотентности клеток используются как молекулярные маркеры, так и функциональные тесты:

1. Молекулярные маркеры: Экспрессия вышеупомянутых транскрипционных факторов (Oct4, Sox2, Nanog), а также других специфических для плюрипотентности генов, является ключевым критерием.
2. Функциональные тесты in vitro:
   • Образование эмбриоидных тел (ЭТ): При культивировании ЭСК или иПСК в условиях, не способствующих поддержанию плюрипотентности, они агрегируют и формируют ЭТ — трехмерные структуры, которые могут спонтанно дифференцироваться во все три зародышевых листка, имитируя ранние стадии эмбрионального развития.
3. Функциональные тесты in vivo:
   • Образование тератом: Золотой стандарт для оценки плюрипотентности. При инъекции плюрипотентных клеток иммунодефицитным мышам они формируют доброкачественные опухоли, называемые тератомами, содержащие производные всех трех зародышевых листков.

Фундаментальная роль ионов кальция в клеточной сигнализации

Ионы кальция (Ca²⁺) — это не просто минерал, необходимый для крепких костей. В микромире клетки Ca²⁺ является одним из самых универсальных и динамичных сигнальных посредников, способным преобразовывать внешние стимулы в сложные внутриклеточные ответы. Это сложный язык, на котором клетки общаются, принимают решения и регулируют свою судьбу. Разве не удивительно, что такой, казалось бы, простой ион может быть ключом к столь сложным биологическим процессам?

Общая характеристика кальциевой сигнализации

На базовом уровне Ca²⁺ действует как универсальный вторичный посредник, или мессенджер, передавая сигналы от внеклеточных стимулов (гормонов, нейротрансмиттеров, факторов роста) к внутриклеточным структурам. В нестимулированных клетках концентрация свободного цитоплазматического Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) строго поддерживается на крайне низком уровне, порядка 100 нМ. Это создает крутой электрохимический градиент, так как внеклеточная концентрация Ca²⁺ значительно выше (порядка мМ).

При стимуляции клетки, [Ca²⁺]_i может стремительно возрастать до пиковых значений 0,5–1 мкМ, запуская каскад событий. Эта временная вспышка Ca²⁺ регулирует множество жизненно важных клеточных процессов:

• Транскрипция генов: Ca²⁺ может активировать или подавлять экспрессию генов, связанных с клеточным циклом, ростом и дифференцировкой.
• Пролиферация: Регулирует клеточное деление.
• Дифференцировка: Направляет стволовые клетки по пути специализации.
• Секреция: Участвует в экзоцитозе везикул, высвобождающих гормоны, нейромедиаторы и ферменты.
• Апоптоз: При определенных условиях Ca²⁺ может стать посредником клеточной гибели.

Примечательно, что Ca²⁺ может выступать не только как вторичный, но и как третичный посредник. Например, когда первичный посредник (гормон) активирует рецептор, это может привести к образованию вторичного посредника (инозитолтрифосфата, InsP₃), который, в свою очередь, вызывает высвобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо. В этом случае Ca²⁺ действует как третичный посредник, углубляя и расширяя сигнальный ответ.

Амбивалентность Ca²⁺ является одной из его важнейших характеристик. Он незаменим для нормального функционирования клетки, но при нарушении гомеостаза может стать мощным индуктором клеточной смерти. Это ключевой нюанс, объясняющий, почему контроль кальциевого баланса так критичен для выживания и правильного функционирования клетки.

Механизмы поддержания гомеостаза кальция

Клетка обладает сложной системой контроля Ca²⁺-гомеостаза, которая обеспечивает поддержание низкой базальной концентрации и быстрое, точное реагирование на сигналы. Поступление Ca²⁺ в цитоплазму осуществляется двумя основными путями:

1. Из внеклеточного пространства:
   • Потенциал-зависимые Ca²⁺-каналы (ПОКК): Открываются в ответ на деполяризацию мембраны.
   • Рецептор-активируемые Ca²⁺-каналы (РАКК): Активируются при истощении внутриклеточных Ca²⁺-депо.
   • Каналы TRP (Transient Receptor Potential): Разнообразная группа каналов, реагирующих на широкий спектр стимулов.

   Поступление Ca²⁺ по градиенту концентрации через эти каналы происходит значительно быстрее, чем транспорт через обменники и помпы, что обеспечивает моментальную реакцию клетки.

2. Из внутриклеточных депо:
   • Эндоплазматический ретикулум (ЭПР): Основное внутриклеточное депо Ca²⁺. Высвобождение Ca²⁺ из ЭПР опосредуется несколькими типами рецепторов:
     • Инозитол-3-фосфатные рецепторы (InsP₃R): Активируются InsP₃, вторичным посредником, образующимся при активации G-белок-связанных рецепторов.
     • Рианодин-чувствительные рецепторы (RyR): Играют ключевую роль в возбуждении-сокращении в мышцах, но также присутствуют в других типах клеток.
     • Рецепторы, чувствительные к никотиновой кислоте аденин-динуклеотид-фосфату (НААДФ): Задействованы в высвобождении Ca²⁺ из лизосомальных депо.

Системы удаления Ca²⁺ из цитоплазмы:
Для поддержания низкой базальной концентрации и завершения Ca²⁺-сигнала клетка активно выводит Ca²⁺ из цитоплазмы:

• Ca²⁺-АТФазы:
  • Плазматические мембранные Ca²⁺-АТФазы (ПМЦА): Выкачивают Ca²⁺ из клетки, используя энергию АТФ.
  • Ca²⁺-АТФазы сарко(эндо)плазматического ретикулума (СЕРЦА): Закачивают Ca²⁺ обратно в ЭПР.
• Na⁺/Ca²⁺-обменники (НКС): Используют градиент Na⁺ для выведения Ca²⁺ из клетки (обычно 3 Na⁺ на 1 Ca²⁺).

Нарушение этих тонко настроенных механизмов может привести к хаосу: чрезмерная стимуляция или дефекты регуляции Ca²⁺-гомеостаза часто становятся причиной гибели клетки.

Динамика и кодирование кальциевых сигналов

Одной из самых удивительных особенностей Ca²⁺-сигнализации является ее способность к кодированию информации. Клетка не просто реагирует на «много» или «мало» Ca²⁺, но и интерпретирует пространственно-временную организацию его подъема. Различные клеточные ответы зависят не только от амплитуды Ca²⁺-сигнала, но и от его длительности, частоты осцилляций и формы волн.

Типы Ca²⁺-сигналов и их значение:

• Плавное повышение концентрации Ca²⁺: Характерно для устойчивых, долгосрочных ответов, таких как пролиферация или метаболические изменения.
• Осциллирующие всплески Ca²⁺ (Ca²⁺-осцилляции): Периодические повышения и понижения Ca²⁺. Частота и амплитуда этих осцилляций могут нести специфическую информацию, активируя разные эффекторные белки. Например, в мезенхимальных стромальных клетках (МСК) паратгормон может вызывать плавное повышение Ca²⁺, способствующее остеогенной дифференцировке, или осциллирующие всплески, подавляющие ее.
• Ca²⁺-волны: Распространяющиеся по цитоплазме волны повышения Ca²⁺, которые могут быть инициированы в одной точке и распространяться на значительные расстояния, координируя ответы в разных частях клетки или даже между соседними клетками.

Эта сложная динамика позволяет Ca²⁺-сигналам к авторегуляции — Ca²⁺ сам управляет генерацией и модуляцией информации, которую он несет. Разнообразие этих паттернов объясняет, как один и тот же ион может регулировать столь широкий спектр клеточных функций, от сокращения мышц до тонкой настройки иммунного ответа и судьбы стволовых клеток.

Прямое и опосредованное влияние ионов кальция на нуклеиновые кислоты и хроматин

Традиционно, когда речь заходит о кальциевой сигнализации, фокус чаще всего смещается на ее взаимодействие с белками-эффекторами в цитоплазме. Однако, чтобы понять молекулярный механизм утраты полипотентности, необходимо глубже рассмотреть, как эти универсальные ионы могут напрямую или опосредованно влиять на саму сердцевину клеточной идентичности — нуклеиновые кислоты и хроматин. Именно здесь, в ядре, хранятся генетические программы, определяющие судьбу стволовой клетки.

Кальций-зависимая модуляция транскрипции генов

Ядро клетки, где находятся ДНК и хроматин, долгое время считалось относительно изолированным от быстрых Ca²⁺-сигналов цитоплазмы. Однако современные исследования показывают, что Ca²⁺-волны способны проникать в нуклеоплазму через ядерные поры. Это проникновение позволяет ионам кальция напрямую модулировать транскрипцию генов в ядре.

Механизмы влияния Ca²⁺ на транскрипцию:

1. Активация факторов транскрипции: Внутриядерное повышение Ca²⁺ может напрямую активировать ряд ключевых факторов транскрипции, которые, в свою очередь, регулируют экспрессию генов. Примеры включают:
   • NFAT (Ядерный фактор активированных Т-клеток): Ca²⁺-кальмодулин-зависимая протеинфосфатаза кальциневрин активирует NFAT, дефосфорилируя его и позволяя ему транслоцироваться в ядро, где он связывается с ДНК и активирует экспрессию генов, связанных с иммунным ответом, пролиферацией и дифференцировкой.
   • NF-κB (Ядерный фактор каппа-легкой цепи-усилитель активированных В-клеток): Хотя NF-κB преимущественно регулируется другими путями, Ca²⁺-сигнализация может модулировать его активность, влияя на киназы, которые регулируют его ядерную транслокацию и связывание с ДНК.
   • AP-1 (Активаторный белок 1): Активность AP-1, состоящего из белков семейства Fos и Jun, также может быть модулирована Ca²⁺-зависимыми киназами, влияющими на пролиферацию и дифференцировку.
2. Стимуляция генов клеточного цикла: Повышение внутриклеточного уровня Ca²⁺, часто через активацию Ca²⁺-входа, может стимулировать транскрипцию генов, связанных с клеточным циклом. Это критически важно для пролиферации стволовых клеток, но чрезмерная или неправильно регулируемая активация может нарушить баланс между самообновлением и дифференцировкой, потенциально толкая клетку к утрате полипотентности.

Взаимодействие ионов кальция с белками хроматина

Влияние Ca²⁺ на нуклеиновые кислоты не ограничивается только активацией транскрипционных факторов. Ионы кальция могут влиять на саму структуру хроматина и активность ферментов, которые ее регулируют. Это является одной из «слепых зон» в исследованиях, требующей более глубокого изучения.

Предполагаемые механизмы влияния Ca²⁺ на хроматин:

1. Модуляция активности ферментов эпигенетической регуляции:
   • ДНК-метилтрансферазы (ДНМТ) и деметилазы (ТЕТ): Активность этих ферментов, регулирующих метилирование ДНК, может быть чувствительна к изменениям концентрации Ca²⁺ или Ca²⁺-зависимым сигнальным путям. Например, Ca²⁺-кальмодулин-зависимые киназы (CaMK) могут фосфорилировать другие белки, которые, в свою очередь, влияют на активность ДНМТ или ТЕТ. Изменение метилирования ДНК в промоторных областях генов-регуляторов плюрипотентности может привести к их подавлению или, наоборот, к активации генов дифференцировки.
   • Гистон-модифицирующие ферменты (ГАТ, ГДАЦ, ГМТ, ГДМ): Активность этих ферментов, контролирующих ацетилирование и метилирование гистонов, также может быть регулирована Ca²⁺-сигнализацией. Например, некоторые ГДАЦ являются Ca²⁺/кальмодулин-зависимыми или активируются CaMK. Изменения в паттернах модификаций гистонов могут изменять доступность хроматина, способствуя переключению клетки из плюрипотентного состояния в дифференцированное.
2. Влияние на АТФ-зависимые комплексы перестройки хроматина: Белки, такие как Chd1 и BAF, используют энергию АТФ для изменения структуры нуклеосом. Ca²⁺, будучи регулятором АТФазной активности многих белков, потенциально может влиять на эффективность работы этих комплексов. Модуляция их активности может изменить открытость хроматина в областях генов плюрипотентности, тем самым влияя на их экспрессию.

Влияние кальция на стабильность генома

Дисбаланс Ca²⁺-гомеостаза может иметь более глубокие последствия, затрагивая даже стабильность генома. Известно, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК), по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), склонны к накоплению дупликаций или делеций генов, особенно в областях, содержащих гены плюрипотентности. Это явление, известное как геномная нестабильность, может быть связано с Ca²⁺-сигнализацией.

Предполагаемые связи между Ca²⁺ и геномной нестабильностью:

1. Оксидативный стресс: Нарушение Ca²⁺-гомеостаза может приводить к избыточной продукции активных форм кислорода (АФК). АФК являются мощными индукторами повреждений ДНК, включая одно- и двухцепочечные разрывы, которые, если не будут эффективно репарированы, могут привести к дупликациям, делециям или другим хромосомным аберрациям.
2. Репликационный стресс: Изменения в Ca²⁺-сигнализации могут влиять на эффективность и точность репликации ДНК. Например, Ca²⁺-зависимые киназы могут регулировать белки, участвующие в репликации и контрольных точках клеточного цикла. Нарушение этих механизмов может приводить к репликационному стрессу, увеличению количества ошибок при репликации и, как следствие, к геномной нестабильности.
3. Активация сигнальных путей повреждения ДНК: Повышение Ca²⁺ может активировать каскады, связанные с ответом на повреждение ДНК, которые, в свою очередь, могут влиять на стабильность генома. Например, киназа 1 контрольной точки клеточного цикла CHK1 играет роль в ответе на репликационный стресс. Модуляция ее активности через Ca²⁺-зависимые пути может влиять на то, как клетка справляется с повреждениями ДНК.

Понимание этих прямых и опосредованных влияний Ca²⁺ на нуклеиновые кислоты и хроматин является критически важным для полного раскрытия молекулярных механизмов, лежащих в основе утраты полипотентности стволовых клеток.

Кальций-зависимые сигнальные пути и белки в регуляции дифференцировки и пролиферации стволовых клеток

В мире стволовых клеток Ca²⁺ не просто передает сигналы, он выступает как тонкий регулятор, способный направлять клетку по сложному пути дифференцировки или поддерживать ее в состоянии пролиферации. Эта глава посвящена конкретным кальций-зависимым сигнальным путям и белкам, которые играют ключевую роль в определении судьбы стволовых клеток. Именно эти механизмы помогают нам понять, почему и как стволовые клетки теряют свою универсальность.

Кальциевые ответы и дифференцировка МСК

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) — это мультипотентные стволовые клетки, способные дифференцироваться в различные типы клеток, такие как остеоциты, хондроциты и адипоциты. Исследования МСК показали, что не только наличие, но и форма кальциевого ответа имеет решающее значение для их дифференцировки.

Один из ярких примеров — действие паратгормона (ПТГ). Этот гормон, регулирующий обмен кальция и фосфатов, может вызывать в МСК два принципиально разных типа кальциевых сигналов, каждый из которых приводит к уникальному клеточному ответу:

• Плавное повышение внутриклеточного кальция: В МСК, выделенных из жировой ткани, паратгормон часто вызывает устойчивое, плавное повышение [Ca²⁺]_i. Этот тип ответа коррелирует с проостеогенным действием, то есть способствует дифференцировке МСК в остеоциты (клетки костной ткани). Механизм этого плавного прироста может быть обусловлен притоком кальция из саркоплазматического ретикулума через рианодин-чувствительные каналы (RyR).
• Осциллирующие всплески кальция: В МСК из надкостницы (периост), паратгормон преимущественно вызывает осциллирующие кальциевые ответы — периодические, ритмичные всплески [Ca²⁺]_i. Интересно, что этот паттерн подавляет остеогенную дифференцировку. Осцилляции, в отличие от плавного подъема, зависят от базального уровня внутриклеточного кальция и часто опосредуются инозитол-3-фосфатными рецепторами (InsP₃R), которые задействованы во всех типах кальциевых ответов в МСК.

Это демонстрирует, что клетка не просто «считывает» уровень Ca²⁺, но и интерпретирует его динамику, используя «кальциевый язык» для принятия решений о своей судьбе. Эти паттерны опосредуются активацией различных сигнальных путей: паратгормон запускает как G_q/фосфолипаза С/кальций, так и G_s/аденилатциклаза/цАМФ пути. Преобладание того или иного пути, вероятно, определяет форму кальциевого сигнала и последующий клеточный ответ.

Роль кальмодулина и других Ca²⁺-связывающих белков

Чтобы Ca²⁺ мог выполнять свои сигнальные функции, он должен взаимодействовать со специфическими белками-рецепторами. Главным и наиболее изученным из них является кальмодулин (CaM).

Кальмодулин: Универсальный адаптер
Кальмодулин — это высококонсервативный Ca²⁺-связывающий белок, который присутствует в цитоплазме всех эукариотических клеток в высокой концентрации (более 10⁷ молекул на типичную животную клетку, составляя около 1% от общего клеточного белка). CaM не обладает собственной ферментативной активностью, но действует как универсальный адаптер, связывая Ca²⁺ и затем взаимодействуя и активируя более 40 различных мишеней.

Механизм действия CaM:

1. Связывание Ca²⁺: CaM содержит четыре Ca²⁺-связывающих домена типа EF-рука (EF-hand). При повышении [Ca²⁺]_i, ионы кальция связываются с этими доменами, вызывая конформационные изменения в структуре CaM.
2. Активация мишеней: Активированный Ca²⁺-кальмодулин изменяет свою конформацию, что позволяет ему связываться с регуляторными доменами ферментов-мишеней. Это связывание часто приводит к открытию каталитического центра фермента, активируя его.

Основные мишени CaM:

• Протеинкиназы: Ca²⁺-кальмодулин-зависимые протеинкиназы (CaMK) фосфорилируют множество белков, регулируя их активность.
• Протеинфосфатазы: Например, кальциневрин, который дефосфорилирует NFAT, позволяя ему входить в ядро.
• Фосфодиэстеразы: Регулируют уровень циклических нуклеотидов (цАМФ, цГМФ), связывая Ca²⁺-сигнализацию с другими вторичными посредниками.
• Ферменты мышечной подвижности: В гладких мышечных волокнах Ca²⁺-кальмодулин-зависимая протеинкиназа фосфорилирует легкие цепи миозина, инициируя сокращение.
• Структурные белки цитоскелета: CaM контролирует микротрубочки и микрофиламенты, влияя на клеточную форму и подвижность.
• Белки эндо- и экзоцитоза: Регулирует внутриклеточный трафик везикул.

Другие Ca²⁺-связывающие белки:
Помимо кальмодулина, в клетке существует множество других Ca²⁺-связывающих белков, выполняющих различные функции:

• Тропонин C: Изоформа кальмодулина, ключевой регулятор мышечного сокращения в скелетных и сердечных мышцах.
• Кальретикулин и кальсеквестрин: Буферные белки, которые связывают большое количество Ca²⁺ в эндоплазматическом/саркоплазматическом ретикулуме, регулируя его высвобождение и накопление.

В стволовых клетках взаимодействие Ca²⁺ с этими белками, особенно с кальмодулином, определяет активацию специфических сигнальных каскадов, которые в конечном итоге влияют на принятие решения о пролиферации или дифференцировке.

Взаимодействие кальциевой сигнализации с другими сигнальными путями

Кальциевая сигнализация редко действует в изоляции. Она тесно интегрирована с другими ключевыми сигнальными путями, образуя сложную сеть, которая регулирует клеточную судьбу.

Примеры взаимодействий:

• Путь Wnt: Неканонические пути Wnt (например, Wnt-4, Wnt-11) могут приводить к увеличению внутриклеточной концентрации Ca²⁺. Это, в свою очередь, может активировать протеинкиназу C (PKC) и кальций-кальмодулин-зависимые протеинкиназы (CaMK), влияя на цитоскелет, клеточную подвижность и транскрипцию генов. В стволовых клетках Wnt-сигнализация критически важна для поддержания самообновления и регуляции дифференцировки.
• Путь STAT3: Как уже упоминалось, STAT3 важен для поддержания плюрипотентности. Хотя прямой связи Ca²⁺ со STAT3 менее очевидна, косвенные механизмы через Ca²⁺-зависимые киназы могут модулировать активность STAT3 или его регуляторов.
• Путь PI3K/Akt: Этот путь, участвующий в клеточном росте, выживании и пролиферации, также может пересекаться с Ca²⁺-сигнализацией. Некоторые Ca²⁺-зависимые киназы могут фосфорилировать компоненты PI3K/Akt пути, модулируя его активность и, как следствие, влияя на судьбу стволовых клеток.

В лимфоцитах, например, Ca²⁺-сигналы через активацию факторов транскрипции NFAT, NF-κB, AP-1 приводят к экспрессии иммуномодулирующих цитокинов. Активация T-клеточных рецепторов, опосредованная Ca²⁺, критична для развития, пролиферации, клеточной гибели, продукции цитокинов и дифференцировки T-клеток. Эти примеры подчеркивают, что Ca²⁺-сигнализация является не просто параллельным путем, а интегрированным компонентом сложной клеточной регуляторной сети.

Молекулярные механизмы утраты полипотентности под действием дисбаланса кальциевого гомеостаза

Утрата полипотентности — это критическое событие в жизни стволовой клетки, означающее переход от состояния универсальности к специализированной функции. Этот процесс может быть как физиологическим, так и патологическим. Дисбаланс кальциевого гомеостаза выступает здесь не просто как сопутствующий фактор, а как активный участник, способный напрямую или опосредованно толкать клетку к потере ее уникальных свойств. Что же именно происходит на молекулярном уровне, когда этот хрупкий баланс нарушается?

Кальций-зависимый апоптоз и некроз

Одним из наиболее драматичных последствий нарушенного кальциевого гомеостаза является запуск программ клеточной смерти. Ионы Ca²⁺, будучи универсальными сигнальными посредниками, играют амбивалентную роль: они необходимы для жизни, но их избыток или неправильное распределение могут стать фатальными.

Как Ca²⁺ запускает клеточную смерть:

1. Чрезмерная стимуляция рецепторов и нарушение регуляции: Длительное или чрезмерное повышение внутриклеточной концентрации Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) может быть вызвано либо постоянной стимуляцией рецепторов, вызывающих вход Ca²⁺ или его высвобождение из депо, либо дефектами в системах выведения Ca²⁺ из цитоплазмы (Ca²⁺-АТФазы, Na⁺/Ca²⁺-обменники).
2. Митохондриальная перегрузка Ca²⁺: Митохондрии активно поглощают Ca²⁺ из цитоплазмы. Однако при длительно повышенном [Ca²⁺]_i митохондрии перегружаются кальцием, что приводит к открытию митохондриальной поры проницаемости (МПП). Открытие МПП вызывает деполяризацию митохондриальной мембраны, потерю АТФ, высвобождение проапоптотических факторов (например, цитохрома с) и необратимое повреждение митохондрий.
3. Активация Ca²⁺-зависимых ферментов: Повышение [Ca²⁺]_i может активировать ряд ферментов, участвующих в деградации клеточных компонентов:
   • Кальпаины (Ca²⁺-зависимые протеазы): Расщепляют белки цитоскелета, ферменты и транскрипционные факторы, нарушая целостность клетки.
   • Фосфолипазы: Деградируют мембранные липиды, повреждая клеточные и органеллярные мембраны.
   • Эндонуклеазы: Расщепляют ДНК, приводя к ее фрагментации, характерной для апоптоза.
4. Некроз vs. Апоптоз: Хотя Ca²⁺ может запускать как апоптоз (программируемую клеточную смерть), так и некроз (неконтролируемую гибель клетки), часто именно длительное, неконтролируемое повышение Ca²⁺ приводит к некрозу. В контексте стволовых клеток, любая форма клеточной гибели напрямую приводит к утрате полипотентности популяции клеток.

Влияние кальция на эпигенетическую перестройку

Эпигенетический ландшафт стволовой клетки определяет ее потенциал к самообновлению и дифференцировке. Дисбаланс Ca²⁺ может стать триггером для нежелательных эпигенетических изменений, способствующих потере полипотентности.

Предполагаемые механизмы:

1. Модуляция активности ДНК-метилтрансфераз (ДНМТ) и деметилаз (ТЕТ):
   • ДНМТ: Активнос��ь этих ферментов, которые добавляют метильные группы к ДНК, может быть чувствительна к Ca²⁺-сигнализации. Изменения в Ca²⁺-зависимых сигнальных путях (например, через CaMK) могут влиять на экспрессию или активность ДНМТ. Гиперметилирование промоторных областей генов плюрипотентности (Oct4, Sox2, Nanog) или гипометилирование генов дифференцировки может привести к необратимой потере плюрипотентного состояния.
   • ТЕТ: Активность ферментов ТЕТ, участвующих в деметилировании ДНК, также может быть модулирована Ca²⁺. Изменения в их функции могут нарушить динамическое равновесие метилирования/деметилирования, характерное для плюрипотентных клеток.
2. Влияние на гистон-модифицирующие ферменты: Ca²⁺-сигналы могут влиять на активность гистон-ацетилтрансфераз (ГАТ), гистон-деацетилаз (ГДАЦ), гистон-метилтрансфераз (ГМТ) и гистон-деметилаз (ГДМ).
   • Например, некоторые ГДАЦ являются Ca²⁺/кальмодулин-зависимыми. Изменения в ацетилировании или метилировании гистонов могут привести к изменению открытости хроматина, делая гены дифференцировки более доступными для транскрипции и подавляя гены плюрипотентности.
3. Эпигенетическая «память» иПСК: Изначально, иПСК могут сохранять «эпигенетическую память» исходного соматического состояния, выражающуюся в специфических паттернах метилирования ДНК и модификаций гистонов. Дисбаланс Ca²⁺ может усугублять эту «память» или, наоборот, быть частью механизмов ее устранения. Неконтролируемый кальциевый сигналинг может закрепить «неправильные» эпигенетические метки, ограничивая дифференцировочный потенциал иПСК.

Гипотезы о необратимой потере плюрипотентности (Теория кальциевого накопления)

Вопрос о том, как стволовая клетка необратимо теряет свою плюрипотентность, является центральным в биологии стволовых клеток. В этом контексте возникают гипотезы, связывающие хронические изменения в кальциевой сигнализации с этим необратимым процессом.

«Теория кальциевого накопления»:
Хотя явно сформулированной и общепризнанной «теории кальциевого накопления» как единой концепции в академической литературе может не существовать в строго этом названии, сама идея того, что хроническое или критическое накопление Ca²⁺ может вести к необратимой потере плюрипотентности, вполне логично вытекает из вышеупомянутых механизмов.

Основные положения гипотетической «теории кальциевого накопления» могут включать:

1. Хроническая митохондриальная дисфункция: Длительное повышенное внутриклеточное Ca²⁺ приводит к хронической перегрузке митохондрий кальцием. Это вызывает постоянный стресс для митохондрий, их дисфункцию, снижение производства АТФ и повышенную продукцию АФК. Поврежденные митохондрии не могут адекватно поддерживать энергетические потребности плюрипотентной клетки и инициируют каскады клеточной гибели или преждевременного старения, что ведет к утрате плюрипотентности.
2. Необратимые эпигенетические модификации: Хронический дисбаланс Ca²⁺ может постоянно активировать или подавлять ферменты, модифицирующие ДНК и гистоны. Например, постоянная активация ГДАЦ или ДНМТ может привести к необратимому «закрытию» хроматина в генах плюрипотентности или «открытию» генов дифференцировки. Эти эпигенетические метки могут стать стабильными и передаваться дочерним клеткам, закрепляя дифференцированное состояние и блокируя возврат к плюрипотентности.
3. Повреждение ДНК и геномная нестабильность: Как уже обсуждалось, дисбаланс Ca²⁺ может способствовать оксидативному и репликационному стрессу, увеличивая количество повреждений ДНК. Если эти повреждения накапливаются в критически важных для плюрипотентности генах (Oct4, Sox2, Nanog), или если механизмы репарации ДНК хронически нарушены, это может привести к необратимым мутациям, делециям или дупликациям, что делает невозможным поддержание плюрипотентного состояния.
4. Изменение клеточного морфогенеза и сигнальных путей: Хроническое нарушение Ca²⁺-гомеостаза может влиять на цитоскелет и клеточную адгезию, изменяя морфологию клетки и ее взаимодействие с микроокружением. Это может сигнализировать о потере плюрипотентности и стимулировать дифференцировку через механотрансдукционные пути.

Таким образом, «теория кальциевого накопления», или, более широко, гипотеза о необратимых изменениях, вызванных хроническим дисбалансом Ca²⁺, предполагает, что избыток или неправильная динамика Ca²⁺ не просто запускает временные ответы, а запускает каскад событий, который в конечном итоге перепрограммирует клетку на необратимую потерю ее универсального потенциала.

Экспериментальные методы изучения роли инов кальция в стволовых клетках

Для того чтобы разгадать сложный «кальциевый язык» стволовых клеток и понять его роль в утрате полипотентности, исследователи используют целый арсенал высокотехнологичных экспериментальных методов. Эти подходы позволяют не только измерить концентрацию Ca²⁺, но и проследить его динамику, идентифицировать ключевые молекулярные мишени и манипулировать кальциевой сигнализацией для изучения ее последствий.

Методы измерения внутриклеточного кальция

Основой для изучения Ca²⁺-сигнализации является точное и быстрое измерение его внутриклеточной концентрации.

1. Флуоресцентные хелаторы кальция: Это наиболее распространенный и мощный метод.
   • Принцип действия: Хелаторы кальция (например, Fura-2, Fluo-3, GCaMP) представляют собой молекулы, которые при связывании с Ca²⁺ изменяют свои флуоресцентные свойства (интенсивность эмиссии, длину волны эмиссии или возбуждения).
   • Применение: Клетки инкубируют с неактивной формой хелатора, которая проникает через клеточную мембрану и внутри клетки гидролизуется до активной формы. Затем, с помощью флуоресцентной микроскопии (конфокальной, широкопольной) или проточной цитометрии, регистрируют изменения флуоресценции, которые напрямую коррелируют с изменениями [Ca²⁺]_i.
   • Преимущества: Позволяют проводить количественные измерения, визуализировать пространственно-временную динамику Ca²⁺-волн и осцилляций в реальном времени, а также анализировать изменения в отдельных клетках или клеточных популяциях.
   • Оборудование: Спектрофлуориметры, флуоресцентные микроскопы с высокоскоростными камерами, проточные цитометры.
2. Генетически кодируемые Ca²⁺-индикаторы: Это белки (например, семейство GCaMP), которые флуоресцируют при связывании с Ca²⁺ и могут быть экспрессированы в клетках путем генетической инженерии.
   • Преимущества: Позволяют изучать Ca²⁺-сигнализацию в конкретных клеточных компартментах (цитоплазма, ядро, митохондрии) и проводить долгосрочные наблюдения без необходимости вводить внешние красители.

Фармакологический и генетический ингибиторный анализ

Для выяснения молекулярных механизмов формирования различных Ca²⁺-сигнальных ответов используются специфические химические соединения или генетические подходы, которые модулируют активность компонентов кальциевой сигнализации.

1. Фармакологические агенты:
   • Ингибиторы и активаторы ионных каналов:
     • Блокаторы L-типа Ca²⁺-каналов: Например, нифедипин, верапамил. Позволяют оценить вклад внешнего Ca²⁺-входа в общий Ca²⁺-сигнал.
     • Блокаторы InsP₃R: Например, 2-аминоэтоксидифенил борат (2APB). Используется для выяснения роли InsP₃-зависимого высвобождения Ca²⁺ из ЭПР.
     • Агонисты/антагонисты RyR: Кофеин (активатор), рианодин (в высоких концентрациях блокирует).
   • Ингибиторы Ca²⁺-АТФаз (СЕРЦА, ПМЦА): Например, тапсигаргин (ингибитор СЕРЦА). Позволяет оценить роль закачивания Ca²⁺ в депо или из клетки в формировании Ca²⁺-сигнала.
   • Хелаторы внеклеточного Ca²⁺: Например, ЭГТА (EGTA). Используется для изучения Ca²⁺-сигналов, независимых от внешнего Ca²⁺.
   • Ингибиторы лизосомальных Ca²⁺-каналов: Позволяют исследовать вклад лизосом как Ca²⁺-депо.
2. Генетические подходы:
   • Нокаут/нокдаун генов: Использование технологий CRISPR/Cas9 или РНК-интерференции (siRNA/shRNA) для выборочного подавления экспрессии генов, кодирующих Ca²⁺-каналы, рецепторы, или Ca²⁺-связывающие белки. Это позволяет определить специфическую роль каждого компонента в Ca²⁺-сигнализации и клеточных ответах.
   • Надэкспрессия генов: Введение дополнительных копий генов, кодирующих интересующие белки, для усиления их функции.

Молекулярно-биологические и цитометрические методы

Для комплексной оценки влияния Ca²⁺-сигнализации на судьбу стволовых клеток, помимо прямых измерений кальция, используются методы, оценивающие экспрессию генов, фенотипические изменения и функциональные характеристики.

1. Культуральные методы in vitro:
   • Моделирование дифференцировки: Культивирование стволовых клеток в различных средах с добавлением факторов дифференцировки (например, остеогенных или адипогенных индукторов) или модуляторов Ca²⁺-сигнализации.
   • Оценка пролиферации: Измерение скорости клеточного деления (например, с помощью МТТ-теста или подсчета клеток).
2. Молекулярно-биологические методы:
   • ПЦР в реальном времени (ОТ-КПЦР): Для количественной оценки уровня экспрессии генов, связанных с плюрипотентностью (Oct4, Sox2, Nanog), дифференцировкой (например, ALPL — щелочная фосфатаза для остеогенной дифференцировки), или компонентами Ca²⁺-сигнального пути.
   • Вестерн-блоттинг: Для анализа экспрессии белков, их модификаций (например, фосфорилирования) и активности.
   • Иммунофлуоресценция/иммуногистохимия: Для визуализации локализации белков внутри клеток и тканей.
3. Методы клеточной биологии и цитометрии:
   • Проточная цитометрия: Позволяет оценить фенотипические характеристики клеток (экспрессию поверхностных маркеров плюрипотентности или дифференцировки), жизнеспособность, апоптоз и клеточный цикл.
   • Дифференциальное цитологическое окрашивание: Для визуализации и оценки дифференцировки клеток (например, окрашивание на липидные капли для адипогенной дифференцировки, или на кальциевые отложения для остеогенной дифференцировки).
   • Иммуноферментный анализ (ИФА): Для количественного определения белков, таких как остеокальцин (маркер остеогенной дифференцировки), или цитокинов и хемокинов в супернатантах клеточных культур.
   • Компьютерная морфометрия: Для объективной оценки общей площади минерализации (при остеогенной дифференцировке) или числа клеток.

Пример ключевых результатов: Используя комбинацию этих методов, исследования показали, что в мультипотентных мезенхимальных стромальных/стволовых клетках (ММСК-ЖТ), различные кальциевые ответы, вызванные паратгормоном, могут быть ингибированы специфическими блокаторами (например, 2APB для InsP₃R), подтверждая молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования этих сигналов и их влияния на остеогенную дифференцировку.

Гипотезы будущего: Некоторые исследователи предполагают, что раковые клетки могут «перепрограммировать» Ca²⁺-сигналы, чтобы способствовать неконтролируемому росту или избегать Ca²⁺-зависимого апоптоза. Это подчеркивает потенциальную терапевтическую цель: манипулирование кальциевой сигнализацией для контроля клеточной судьбы, как в случае борьбы с раком, так и в контексте регенеративной медицины для управления плюрипотентностью стволовых клеток.

Заключение

Исследование роли ионов кальция в молекулярном механизме утраты полипотентности стволовых клеток открывает перед нами картину удивительной сложности и тонкости клеточной регуляции. Мы увидели, что полипотентность стволовых клеток – будь то эмбриональные или индуцированные – является результатом сложного взаимодействия генетических и эпигенетических механизмов, которые тщательно контролируют их самообновление и способность к дифференцировке.

В этом оркестре клеточных процессов ионы кальция выступают в роли универсального дирижера, способного передавать внеклеточные сигналы, модулировать транскрипцию генов, регулировать пролиферацию и дифференцировку, а в критических случаях даже запускать клеточную смерть. Сложная пространственно-временная организация кальциевых сигналов – от плавного повышения до ритмичных осцилляций – позволяет клеткам кодировать и интерпретировать разнообразную информацию, определяющую их судьбу.

Особое внимание было уделено прямому и опосредованному влиянию ионов кальция на нуклеиновые кислоты и хроматин. Мы выяснили, что Ca²⁺-волны могут проникать в ядро, активируя ключевые факторы транскрипции и стимулируя экспрессию генов, связанных с клеточным циклом. Кроме того, существует убедительное основание полагать, что дисбаланс кальциевого гомеостаза может модулировать активность ферментов эпигенетической регуляции (ДНК-метилтрансфераз, гистон-модифицирующих ферментов) и влиять на стабильность генома, приводя к дупликациям, делециям и, как следствие, к утрате плюрипотентности.

Мы систематизировали роль специфических кальций-зависимых сигнальных путей и белков, таких как кальмодулин, в регуляции дифференцировки стволовых клеток. Различные паттерны кальциевых ответов в мезенхимальных стромальных клетках, вызванные паратгормоном, наглядно демонстрируют, как динамика Ca²⁺ может направлять клетку по пути остеогенной дифференцировки или, наоборот, подавлять ее.

Нарушенный кальциевый гомеостаз может напрямую приводить к утрате полипотентности через запуск кальций-зависимого апоптоза или некроза, а также через дестабилизацию эпигенетического ландшафта. Гипотеза о «кальциевом накоплении», хотя и требующая дальнейшего уточнения, подчеркивает возможность необратимых изменений, вызванных хроническим дисбалансом Ca²⁺, которые могут окончательно закрепить дифференцированное состояние.

Современные экспериментальные методы, от флуоресцентных хелаторов кальция и генетически кодируемых индикаторов до фармакологического ингибиторного анализа и молекулярно-биологических техник, предоставляют ученым мощные инструменты для дальнейшего изучения этой сложной системы. Эти исследования не только углубляют наше фундаментальное понимание биологии стволовых клеток, но и открывают новые перспективы для регенеративной медицины. Контроль кальциевого гомеостаза может стать ключом к манипулированию судьбой стволовых клеток, позволяя нам направленно управлять их дифференцировкой или поддерживать их в полипотентном состоянии для терапевтических целей. Будущие исследования, фокусирующиеся на тонких взаимодействиях Ca²⁺-сигнализации с генетическими и эпигенетическими механизмами, несомненно, приведут к новым прорывам в этой захватывающей области науки.

Список использованной литературы

1. Гаврилов, Л. А., Гаврилова, Н. С. Биология продолжительности жизни / Отв. ред. В. П. Скулачев. 2-е изд. М.: Наука, 1991. С. 154-159.
2. Монтрель, М. М., Шабарчина, Л. И., Плетнева, Т. В., Ершов, Ю. А. ИК-спектроскопическое изучение взаимодействия солей хрома с природной ДНК // Биофизика. 1993. Т. 38, вып. 4. С. 636-643.
3. Орлов, С. Н., Лобас, Ю. А. Концентрация свободного кальция в цитоплазме: методы регистрации, достижения, артефакты // Биол. мембраны. 1989. Т. 6. С. 901.
4. Структура и стабильность биологических макромолекул / Пер. с англ. ред. М. В. Волькенштейна. М.: Мир, 1973. С. 359-573.
5. Фролькис, В. В. Регулирование, приспособление и старение. Л.: Наука, 1970. 160 с.
6. Молекулярные основы поддержания самообновления и плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток млекопитающих // Цитология. 2020. Т. 62, № 9. С. 611-622. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/molekulyarnye-osnovy-podderzhaniya-samoobnovleniya-i-plyuripotentnosti-embrionalnyh-stvolovyh-kletok-mlekopitayuschih (дата обращения: 03.11.2025).
7. Некоторые особенности действия ионов кальция в клетках в качестве сигнальной молекулы. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/nekotorye-osobennosti-deystviya-ionov-kaltsiya-v-kletkah-v-kachestve-signalnoy-moleku (дата обращения: 03.11.2025).
8. Молекулярные механизмы регуляции ПТГ-зависимой кальциевой сигнализации в постнатальных стволовых клетках. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/molekulyarnye-mehanizmy-regulyatsii-ptg-zavisimoy-kaltsievoy-signalizatsii-v-postnatalnyh-stvolovyh-kletkah (дата обращения: 03.11.2025).
9. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки: от получения до применения в биохимических и биомедицинских исследованиях. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/indutsirovannye-plyuripotentnye-stvolovye-kletki-ot-polucheniya-do-primeneniya-v-biohimicheskih-i-biomeditsinskih-issledovaniyah (дата обращения: 03.11.2025).
10. Журнал мембранной и клеточной биологии. 2022. Т. 39, № 1. URL: https://www.membranecell.ru/jour/article/view/100 (дата обращения: 03.11.2025).
11. Применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в стоматологии. URL: https://medprint.ru/jour/article/view/154 (дата обращения: 03.11.2025).
12. Функциональное состояние гормональных систем регуляции обмена кальция. URL: https://online.zakon.kz/Document/?doc_id=31450280 (дата обращения: 03.11.2025).
13. Гормональные регуляторы обмена кальция и фосфора. URL: https://bookonlime.ru/textbooks/biochemistry_for_exams/page/gormonalnye_regulyatory_obmena_kaltsiya_i_fosfora (дата обращения: 03.11.2025).
14. Ранние маркеры гемопоэтической дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека // Медицинская иммунология. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/rannie-markery-gemopoeticheskoy-differentsirovki-indutsirovannyh-plyuripotentnyh-stvolovyh-kletok-cheloveka (дата обращения: 03.11.2025).
15. Эндогенный потенциал стволовых клеток. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/endogennyy-potentsial-stvolovyh-kletok (дата обращения: 03.11.2025).
16. Кальциевая сигнализация в лимфоцитах. Хабаровск: Дальневосточный государственный медицинский университет, 2014. URL: https://www.fesmu.ru/elib/Data/2014/trudy/2014-04-03.pdf (дата обращения: 03.11.2025).
17. Нуклеопротеины отвечают за продолжение жизни клетки. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/nukleoproteiny-otvechayut-za-prodolzhenie-zhizni-kletki (дата обращения: 03.11.2025).
18. Иванов, П. А. Диссертация. Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2021. URL: https://pharm.medlib.ru/assets/pdf/dissertations/2021/ivanovpa/dissertation.pdf (дата обращения: 03.11.2025).
19. Эпигенетика плюрипотентных клеток. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/epigenetika-plyuripotentnyh-kletok (дата обращения: 03.11.2025).
20. Обмен нуклеиновых кислот. Казань: Казанский федеральный университет. URL: https://kpfu.ru/portal/docs/F_1409748615/Obmen.nukleinovyh.kislot.i.nukleoproteidov.pdf (дата обращения: 03.11.2025).
21. Роль ионов Ca2+ при передаче сигналов в клетках растений. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/rol-ionov-sa2-pri-peredache-signalov-v-kletkah-rasteniy (дата обращения: 03.11.2025).
22. Кальциевая сигнальная система. Краснодар: Аграрно-технологический институт КубГАУ. URL: https://kubsau.ru/upload/iblock/58f/58f8e02d84c3c332565022e37905186b.pdf (дата обращения: 03.11.2025).
23. Стволовые клетки // Википедия. URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D1%82%D0%B2%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B2%D1%8B%D0%B5_%D0%BA%D0%BB%D0%B5%D1%82%D0%BA%D0%B8 (дата обращения: 03.11.2025).
24. Загадочный кальциевый язык // Биомолекула. URL: https://biomolecula.ru/articles/zagadochnyi-kaltsievyi-iazyk (дата обращения: 03.11.2025).