Роль спектральных и хроматографических методов в контроле качества лекарств
В современной фармацевтической аналитике, где требования к безопасности, эффективности и качеству лекарственных препаратов (ЛП) постоянно ужесточаются, центральное место занимают высокоточные и воспроизводимые физико-химические методы анализа. Среди них ультрафиолетовая (УФ) спектрофотометрия и тонкослойная хроматография (ТСХ) обладают уникальным сочетанием доступности, надежности и высокой применимости, что делает их незаменимыми инструментами в лабораторной практике и регуляторном контроле.
УФ-спектрофотометрия, как метод, основанный на взаимодействии электромагнитного излучения с веществом, является эталонным подходом для быстрого и точного количественного определения активных фармацевтических ингредиентов (АФИ), а также служит первичным критерием подлинности. В свою очередь, ТСХ — это высокоэффективный метод разделения смесей, критически важный для контроля чистоты и обнаружения родственных примесей, которые могут возникать в процессе синтеза или хранения ЛП; при этом именно интеграция этих двух подходов позволяет получить наиболее полную картину о качестве анализируемого образца, что и требуется современными стандартами.
Цель данной работы — провести академический синтез теоретических основ, практического применения и строгих фармакопейных требований, регламентирующих использование УФ-спектрофотометрии и ТСХ. В результате будет создан исчерпывающий материал, демонстрирующий, как эти два метода, действуя в интеграции, формируют надежную основу для контроля качества лекарственных средств в соответствии со стандартами Государственной Фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ).
Теоретические основы УФ-спектрофотометрии и количественный анализ
Принципы поглощения и закон Бугера–Ламберта–Бера
УФ-спектроскопия, или электронная спектроскопия, является мощным аналитическим инструментом, основанным на принципе избирательного поглощения молекулами анализируемого вещества энергии электромагнитного излучения в диапазоне от 190 до 780 нм (УФ- и видимая области спектра).
Поглощение УФ-квантов вызывает электронные переходы в молекулах. Эти переходы происходят из занятых молекулярных орбиталей (связывающих ($\sigma$, $\pi$) и несвязывающих (n)) на свободные разрыхляющие орбитали ($\sigma$*, $\pi$*). Энергия, необходимая для таких переходов, находится в диапазоне УФ-излучения. Поскольку органические молекулы, особенно АФИ, часто содержат хромофоры (группы с $\pi$-связями, такие как карбонилы, ароматические кольца или двойные связи), они активно поглощают в этой области, что позволяет использовать метод для их идентификации и количественного анализа.
Количественная зависимость между поглощением света и концентрацией вещества описывается законом Бугера–Ламберта–Бера. Этот закон гласит, что оптическая плотность ($A$) раствора прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества ($c$) и толщине поглощающего слоя ($b$):
A = E ⋅ c ⋅ b
Где:
- $A$ — Оптическая плотность (безразмерная величина).
- $E$ — Молярный показатель поглощения (коэффициент экстинкции), л ⋅ моль-1 ⋅ см-1.
- $c$ — Молярная концентрация вещества, моль/л.
- $b$ — Толщина поглощающего слоя (длина пути света), обычно 1 см.
Закон Бугера–Ламберта–Бера является краеугольным камнем количественной спектрофотометрии. Отклонения от линейности могут возникать при высоких концентрациях (превышающих 0,01 М), когда нарушаются условия взаимодействия между молекулами, или из-за химических процессов в растворе (диссоциация, ассоциация, комплексообразование), что требует тщательного подбора растворителя и концентрационного диапазона. И что из этого следует? Это означает, что для обеспечения валидности результатов аналитик всегда должен подтверждать линейность в рабочем диапазоне концентраций, особенно при работе с новыми или сложными матрицами.
Коэффициенты поглощения и их применение в фармакопее
Для количественного определения АФИ в фармакопейном анализе используются два основных типа коэффициентов поглощения, каждый из которых имеет свою область применения и стандартизацию: молярный показатель поглощения ($E$) и удельный коэффициент поглощения ($A^{1\%}_{1\text{см}}$).
Молярный показатель поглощения ($E$)
Молярный показатель поглощения ($E$) — это фундаментальная физико-химическая константа, численно равная оптической плотности раствора с концентрацией 1 моль/л при толщине слоя 1 см и определенной длине волны ($\lambda_{max}$).
Его основное преимущество заключается в том, что он не зависит от молекулярной массы вещества и является прямым показателем способности хромофора поглощать свет. Он незаменим при работе с чистыми химическими субстанциями и в фундаментальных исследованиях.
Удельный коэффициент поглощения ($A^{1\%}_{1\text{см}}$)
Для целей контроля качества лекарственных средств, где концентрацию удобнее выражать в массовых долях, широко используется Удельный коэффициент поглощения ($A^{1\%}_{1\text{см}}$).
$A^{1\%}_{1\text{см}}$ — это оптическая плотность раствора, в котором концентрация вещества составляет $10 \text{ г}/\text{л}$ (или $1 \text{ г}/\text{100 мл}$) в кювете с толщиной слоя $1 \text{ см}$ (при $20 \pm 1$ °С).
Связь и применение коэффициентов в количественном анализе:
Фармакопейный количественный анализ часто строится на использовании $A^{1\%}_{1\text{см}}$, значение которого регламентируется в частной фармакопейной статье для конкретного АФИ.
Концентрация вещества ($c$, в г/л) рассчитывается по формуле:
c = (A ⋅ 10) / (A¹%₁ᴄᴍ ⋅ b)
| Характеристика | Молярный показатель ($E$) | Удельный коэффициент ($A^{1\%}_{1\text{см}}$) |
|---|---|---|
| Единицы измерения | л ⋅ моль-1 ⋅ см-1 | л ⋅ г-1 ⋅ см-1 (или безразмерная величина при стандартизации) |
| Зависимость от ММ | Не зависит | Косвенно зависит (т.к. концентрация в г/л) |
| Применение в ГФ РФ | Реже, для фундаментальных расчетов | Чаще, как основной стандартный показатель чистоты |
Закон аддитивности
Для анализа многокомпонентных систем (например, смеси АФИ или АФИ с примесями, если примеси поглощают) применяется закон аддитивности. Он гласит, что общая оптическая плотность смеси при данной длине волны равна сумме оптических плотностей отдельных компонентов, при условии, что они не взаимодействуют друг с другом:
A_общ = A₁ + A₂ + ... + Aₙ = Σᵢ₌₁ⁿ (Eᵢ ⋅ cᵢ ⋅ b)
Используя измерения на разных длинах волн ($\lambda_1$ и $\lambda_2$), где один компонент поглощает сильнее другого, можно создать систему линейных уравнений для определения концентрации каждого компонента. Какой важный нюанс здесь упускается? Данный закон применим лишь в идеальных условиях, и в реальной практике фармацевтической аналитики, когда компоненты могут проявлять химическое взаимодействие, аналитику необходимо использовать более сложные подходы, такие как производная спектрофотометрия, чтобы нивелировать ошибки.
Физико-химический механизм и факторы эффективности тонкослойной хроматографии
Механизмы разделения и фактор удерживания
Хроматография — это мощный физико-химический метод разделения сложных смесей, основанный на различном распределении компонентов между двумя фазами: неподвижной (сорбентом) и подвижной (элюентом).
Тонкослойная хроматография (ТСХ) — это плоскостной вариант, где неподвижная фаза представляет собой тонкий слой сорбента (например, силикагеля или оксида алюминия) толщиной 100–250 мкм, нанесенный на твердую инертную подложку.
Разделение в ТСХ происходит в результате конкуренции между силами, действующими на молекулы анализируемого вещества: силой увлечения подвижной фазой и силой удержания неподвижной фазой.
Основные механизмы разделения:
- Адсорбционный механизм: Наиболее распространенный в ТСХ. Разделение происходит за счет различной степени адсорбции компонентов на поверхности твердого сорбента. Более полярные вещества сильнее удерживаются полярным сорбентом (например, силикагелем), и движутся медленнее.
- Распределительный механизм: Происходит, когда сорбент пропитан неподвижной жидкой фазой, и разделение основано на различии коэффициентов распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями.
- Ионообменный механизм: Используется сорбент с ионообменными свойствами, и разделение базируется на различии сродства компонентов к неподвижной фазе.
Фактор удерживания ($R_f$)
Подвижность каждого вещества в ТСХ характеризуется фактором удерживания ($R_f$). Это ключевой критерий идентификации (подлинности) в фармакопейном анализе:
R_f = Расстояние, пройденное зоной вещества / Расстояние, пройденное фронтом подвижной фазы
Величина $R_f$ всегда находится в диапазоне от 0 до 1 ($0 \le R_f \le 1$). Фактор $R_f$ является характеристикой вещества только при строго фиксированных условиях (сорбент, подвижная фаза, температура). Совпадение $R_f$ испытуемого вещества с $R_f$ стандартного образца в идентичных условиях является доказательством подлинности.
Оптимизация разделения: роль сорбента и модификаторов
Эффективность хроматографического разделения (острота и узость зон) напрямую зависит от характеристик неподвижной фазы и состава элюента.
Влияние сорбента
В классической ТСХ используются частицы сорбента размером 10–20 мкм. Для повышения эффективности разделения и разрешения близкородственных компонентов применяется Высокоэффективная ТСХ (ВЭТСХ), где используются пластинки с более тонким слоем и мелкодисперсными частицами (5–7 мкм). Уменьшение размера частиц и повышение однородности их распределения приводит к снижению турбулентности потока и уменьшению продольной диффузии, что в итоге дает более узкие и четкие зоны разделения.
Критическая роль модификаторов
Выбор подвижной фазы является критическим для достижения оптимального разделения. Однако часто для анализа полярных АФИ требуется использование модификаторов — добавок кислого или основного характера (например, уксусной кислоты, аммиака).
Механизм действия модификаторов:
Многие лекарственные вещества являются слабыми кислотами или основаниями. В растворе они могут находиться в равновесии между нейтральной (недиссоциированной) и ионизированной (заряженной) формами. Ионизированные формы, будучи высокополярными, могут демонстрировать сильную адсорбцию или, наоборот, быть слишком растворимыми в полярной подвижной фазе, что приводит к растянутым или «смазанным» зонам.
Добавление модификатора (например, кислоты для слабого основания) смещает равновесие, подавляя ионизацию. Это обеспечивает нахождение подавляющего большинства молекул в одной, нейтральной форме. Результатом является гомогенное взаимодействие вещества с неподвижной фазой, что приводит к:
- Улучшению формы хроматографической зоны (более узкие пятна).
- Повышению воспроизводимости $R_f$.
- Значительному улучшению разрешения между компонентами.
Регуляторная база: Требования Государственной Фармакопеи РФ к УФ-спектрофотометрии и ТСХ
Требования ГФ РФ к УФ-спектрофотометрии (ОФС.1.2.1.1.0003.15)
Государственная Фармакопея РФ (ГФ РФ) устанавливает строгие требования к проведению физико-химических испытаний, обеспечивая унификацию и достоверность результатов в рамках контроля качества ЛП. УФ-спектрофотометрия регламентирована Общей Фармакопейной Статьей ОФС.1.2.1.1.0003.15 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях».
Ключевые фармакопейные требования:
- Аппаратура: Спектрофотометр должен обеспечивать монохроматическое излучение и иметь диапазон работы, охватывающий УФ- и видимую области. Прибор должен быть аттестован и регулярно проверяться на точность шкалы длин волн и шкалы оптической плотности.
- Проведение измерения: Измерения должны проводиться при максимально узкой спектральной ширине щели, чтобы максимально приблизиться к условиям монохроматичности. В качестве растворителей используются те, которые не поглощают в рабочей области спектра (например, вода, этанол, метанол).
- Критерии подлинности (Идентификация): Вещество идентифицируется по длине волны максимума поглощения ($\lambda_{max}$). Полученное значение $\lambda_{max}$ испытуемого раствора не должно отличаться от указанного в фармакопейной статье более чем на $\pm 2$ нм. Спектры сравнения должны быть сняты в одинаковых условиях.
- Количественное определение: Для точного определения концентрации (содержания) АФИ обязательно использование стандартных образцов (СО). Расчет может проводиться по методу калибровочного графика или с использованием стандартизированного значения $A^{1\%}_{1\text{см}}$, указанного в частной статье.
Требования ГФ РФ к ТСХ (ОФС.1.2.1.2.0003.15)
Тонкослойная хроматография регламентируется Общей Фармакопейной Статьей ОФС.1.2.1.2.0003.15 «Тонкослойная хроматография». ТСХ является первичным методом для испытаний на подлинность и родственные примеси (чистоту).
Фармакопейный регламент ТСХ:
- Аппаратура:
- Камеры для хроматографирования: Должны обеспечивать насыщенную среду парами подвижной фазы для воспроизводимости.
- Пластинки: Используются готовые пластинки со слоем сорбента (чаще всего силикагель F254). Индекс F254 означает, что сорбент содержит флуоресцентный индикатор, который светится при 254 нм, позволяя обнаруживать поглощающие вещества как темные пятна на светлом фоне.
- УФ-лампы: Требуется использование УФ-ламп с длиной волны 254 нм (для поглощающих веществ) и 365 нм (для веществ, обладающих естественной флуоресценцией или после обработки флуоресцирующим реактивом).
- Калиброванные капилляры: Для точного нанесения заданного объема пробы (например, 1 мкл).
- Подготовка проб и нанесение: Пробы наносятся в виде пятен диаметром 2–5 мм (или полос 10–20 мм для препаративной ТСХ) на строго установленном расстоянии от края пластинки.
- Испытание на подлинность: Подлинность подтверждается совпадением $R_f$ и характера зоны (цвет, форма, интенсивность) испытуемого вещества с $R_f$ и характером зоны стандартного образца.
- Испытание на родственные примеси (чистоту): Это полуколичественное или количественное испытание. Типичный метод включает сравнение интенсивности пятна примеси в испытуемом растворе с интенсивностью пятна стандарта (или разбавленного стандартного раствора, соответствующего установленному пределу примеси). Если интенсивность пятна примеси не превышает интенсивность пятна стандарта, лекарственное средство считается чистым.
Продвинутые приемы: Интегрированное применение методов для анализа чистоты и примесей
Производная спектрофотометрия как инструмент контроля чистоты
В сложных матрицах, особенно при анализе примесей, спектр которых накладывается на спектр основного вещества, закон аддитивности может быть недостаточен. В этом случае на помощь приходит Производная спектрофотометрия.
Производный спектр представляет собой график первой, второй или более высоких производных оптической плотности по длине волны ($\text{d}A/\text{d}\lambda$, $\text{d}^{2}A/\text{d}\lambda^{2}$ и т.д.).
Принцип второй производной ($\text{d}^{2}A/\text{d}\lambda^{2}$):
Кривая второй производной оптической плотности по длине волны ($\text{d}^{2}A/\text{d}\lambda^{2}$) имеет следующие преимущества:
- Подавление фона: Позволяет устранить влияние фонового поглощения, вызванного мутностью, рассеянием или неспецифическим поглощением матрицы.
- Обнаружение малых примесей: Максимум поглощения основного компонента в спектре второй производной превращается в минимум (или ноль), а спектр примеси, который был скрыт, становится более выраженным. Это позволяет обнаруживать и даже количественно определять примеси, если их концентрация составляет всего 1–5% от концентрации основного вещества.
- Повышение селективности: Вторая производная позволяет получить более узкие и четкие пики, что улучшает разрешение при перекрывающихся спектрах.
Производная спектрофотометрия часто используется для контроля качества ЛП, где необходимо доказать отсутствие следовых количеств продуктов разложения или синтетических примесей, что делает ее важным дополнением к классической ТСХ в испытании на чистоту. Разве не удивительно, что простой математический прием может настолько радикально повысить аналитическую мощность базового метода?
Метрологические характеристики и валидация методов
Для обеспечения надежности и пригодности аналитических методов, используемых в контроле качества лекарственных средств, они должны быть валидированы в соответствии с международными и фармакопейными требованиями. Валидация включает оценку ряда статистических показателей.
Ключевые метрологические характеристики, подтверждающие пригодность методов УФ-спектрофотометрии и ТСХ, включают:
| Характеристика | Определение и применение |
|---|---|
| Точность | Степень близости полученного результата к истинному (или условно истинному) значению. Обеспечивается использованием СО и калиброванного оборудования. |
| Чувствительность (Предел обнаружения/LOQ) | Минимальная концентрация вещества, которая может быть обнаружена (LOD) или надежно определена количественно (LOQ) при заданных статистических параметрах. Критична для испытаний на примеси в ТСХ и УФ-спектрофотометрии. |
| Воспроизводимость (Прецизионность) | Степень близости между результатами независимых измерений, полученных в одинаковых условиях (повторяемость) или в разных условиях (внутрилабораторная воспроизводимость). Высокая воспроизводимость ТСХ зависит от контроля температуры, влажности и насыщения камеры. |
| Селективность (Специфичность) | Способность метода однозначно определять анализируемое вещество при наличии других компонентов (примесей, продуктов распада, компонентов лекарственной формы). В ТСХ селективность регулируется подбором сорбента и подвижной фазы; в УФ-спектрофотометрии — использованием $\lambda_{max}$ или производной спектроскопии. |
Эти статистические показатели гарантируют, что методика, описанная в фармакопейной статье, может быть воспроизведена в любой аккредитованной лаборатории с одинаково высоким уровнем достоверности, что является фундаментальным требованием ВУЗовской аналитической химии и регуляторной практики.
Заключение
Ультрафиолетовая спектрофотометрия и тонкослойная хроматография представляют собой два фундаментальных и взаимодополняющих метода в арсенале фармацевтической аналитики. УФ-спектрофотометрия, основанная на законе Бугера–Ламберта–Бера и количественных показателях $A^{1\%}_{1\text{см}}$, обеспечивает высокоточный и быстрый способ определения количественного содержания АФИ. В то же время, ТСХ, используя принцип разделения на основе различных механизмов (преимущественно адсорбционного) и контролируемый фактор удерживания ($R_f$), является незаменимым инструментом для подтверждения подлинности и критически важного контроля чистоты лекарственных средств.
Оба метода жестко регламентированы Государственной Фармакопеей РФ (ОФС.1.2.1.1.0003.15 и ОФС.1.2.1.2.0003.15), которая устанавливает не только теоретические основы, но и строгие требования к аппаратуре, подготовке проб и критериям оценки (например, допуск $\pm 2$ нм для $\lambda_{max}$).
Интегрированный подход, включающий использование продвинутых приемов, таких как производная спектрофотометрия для обнаружения скрытых примесей и применение модификаторов в ТСХ для оптимизации разделения, позволяет эффективно решать самые сложные задачи контроля качества современных лекарственных препаратов. Таким образом, УФ-спектрофотометрия и ТСХ остаются ключевыми, незаменимыми и академически обоснованными методами, обеспечивающими безопасность и эффективность лекарственных средств на всех этапах их жизненного цикла, а их строгая регламентация гарантирует глобальную гармонизацию стандартов качества.
Список использованной литературы
- Золотов, Ю. А. Основы аналитической химии. В 2 книгах. Книга 2. Методы химического анализа. – Москва: Высшая школа, 2014. – 504 с.
- Хаханина, Т. И., Никитина, Н. С. Аналитическая химия: учебное пособие. – Москва: Юрайт, 2014. – 278 с.
- Ищенко, А. А. Аналитическая химия. – Москва: Академия, 2013. – 320 с.
- Харитонов, Ю. Я. Аналитическая химия. Аналитика. В 2 книгах. Книга 1. Общие теоретические основы. Качественный анализ. – Москва: Высшая школа, 2010. – 616 с.
- Харитонов, Ю. Я., Григорьева, В. Е. Аналитическая химия. Практикум. – Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 296 с.
- Зенкевич, И. Г. и др. Аналитическая химия. В 3 томах. Том 2. Методы разделения веществ и гибридные методы анализа. – Москва: Академия, 2008. – 304 с.
- Васильев, В. П., Кочергина, Л. А., Орлова, Т. А. Аналитическая химия. Сборник вопросов, упражнений и задач. – Москва: ДРОФА, 2006. – 320 с.
- Тонкослойная хроматография (ОФС.1.2.1.2.0003.15). // Фармакопея.рф. URL: https://pharmacopoeia.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- Тонкослойная хроматография. URL: https://regmed.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- ОФС_Тонкослойная_хроматогр… // Министерство здравоохранения РФ. URL: https://minzdrav.gov.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях. URL: https://regmed.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- Методы УФ- и ИК-спектроскопии в анализе лекарственных препаратов и растительных масел. // Электронная библиотека ТГУ. URL: https://tsu.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- Методические указания к курсу аналитической химии. // Химический факультет МГУ. URL: https://msu.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- Современные методы анализа химических соединений. URL: https://bashgmu.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- Хроматография. URL: https://tpu.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- Физико-химические методы анализа. Спектрометрия. URL: https://bmstu.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- Какие преимущества использования ультрафиолетовой спектроскопии в спектральном анализе? URL: https://ya.ru (дата обращения: 29.10.2025).
- Метод УФ-спектроскопии и его применение в органической и физической химии. URL: https://kpfu.ru (дата обращения: 29.10.2025).